《Biotechnology Advances》：Expanding biotechnological applications of
Yarrowia lipolytica: Key advances in the past decade
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这篇综述系统梳理了解脂耶氏酵母（Y. lipolytica）在过去十年中作为非传统产油酵母的卓越进展，重点阐述了其遗传工具包（如启动子、CRISPR-Cas9）、适应性实验室进化（ALE）及代谢工程策略（如推-拉-阻遏策略）在构建高效细胞工厂方面的应用。文章通过核心代谢途径（TCA循环、甲羟戊酸途径、磷酸戊糖途径和脂肪酸生物合成）系统总结了高价值化学品（如有机酸、萜类、脂肪酸衍生物）的生物合成成就，并提出了结合人工智能（AI）引导设计、强化生物过程及精准共培养等新兴技术的未来发展路线图，旨在推动以解脂耶氏酵母为平台菌株的可扩展、循环生物经济的发展。
遗传工具包与解脂耶氏酵母的改造方法
解脂耶氏酵母的成功改造离不开其日益完善的遗传工具包。启动子是调控基因表达的关键元件，可分为组成型和诱导型。常用的强组成型启动子包括TEF1p（翻译延伸因子1α）、FBA1p（果糖二磷酸醛缩酶）和GPD1p（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）等。通过在核心启动子上游添加多个上游激活序列（UAS，如UAS1XPR2），可以构建出强度远超天然启动子的合成启动子。诱导型启动子，如脂肪酸诱导的POX2p、赤藓糖醇诱导的EYK1p以及光诱导的CarO（绿光）和C120（蓝光）启动子，为基因的时空调控提供了有力工具。此外，含有内含子的启动子（如TEF1inp、FBA1INP）能通过内含子介导的增强效应显著提高基因表达水平。
在遗传转化方面，除了经典的LiOAc化学转化法，农杆菌介导转化和电穿孔法也提高了转化效率。CRISPR-Cas9系统的应用极大地推动了基因编辑的效率。通过使用tRNA-sgRNA融合表达策略、抑制非同源末端连接（NHEJ）因子（如KU70/KU80）以增强同源重组（HR）效率，以及利用碱基编辑系统（如Target-AID），实现了高效的基因敲除、敲入和点突变。适应性实验室进化（ALE）是另一种强大的菌株优化策略，通过在不同压力条件下（如高浓度底物、抑制剂环境）进行连续传代，结合全基因组测序和转录组学分析，能够筛选出具有优良性状（如提高柠檬烯耐受性、利用废弃油脂）的进化菌株。菌株杂交技术则通过结合不同亲本的优良性状（如木糖利用能力和代谢物高产能力），为创造新型高产菌株提供了途径。
生物修复应用：通过降解途径净化环境
解脂耶氏酵母因其能够降解烃类化合物和耐受重金属而被广泛应用于生物修复领域。它能够分泌生物表面活性剂，乳化疏水性底物（如正十六烷、柴油、原油），并通过β-氧化途径在有氧条件下将其降解。研究表明，该酵母能有效降解C9-C25链烷烃，降解效率受菌株特性、烃类链长和环境条件影响。在重金属污染治理方面，一些海洋来源的解脂耶氏酵母菌株对钒（V）、钴（Co）、铬（Cr）、铜（Cu）、镍（Ni）、铅（Pb）和锌（Zn）等表现出高耐受性，可通过生物吸附作用去除废水中的重金属离子。通过基因工程手段改造硫代谢途径（如删除MET25基因）获得的产硫化氢菌株，对镉（Cd）、铜（Cu）、铅（Pb）的去除效率超过90%。
单细胞蛋白、单细胞油、酶制剂的生产与非传统原料的利用
解脂耶氏酵母是生产单细胞蛋白（SCP）的理想宿主，其生物质蛋白质含量高，富含必需氨基酸。利用废弃烹饪油（WCO）、粗甘油、甘蔗糖蜜等工农业废弃物作为底物，可获得高达151.2 g/L的SCP产量，可作为鱼饲料和动物饲料的优质蛋白质补充剂。此外，该酵母也是重要的工业酶生产者，特别是脂肪酶（Lip2）。通过固态发酵（SSF）利用亚马逊地区的副产品（如安德iroba油饼和豆粕）可高效生产脂肪酶，酶活最高可达82.52 U/g，用于水解鱼油生产多不饱和脂肪酸。
通过核心代谢途径生产高价值生化产品
三羧酸（TCA）循环衍生物
解脂耶氏酵母是生产多种有机酸的优秀平台。通过代谢工程改造，其TCA循环中间体的产量显著提高。例如，敲除琥珀酸脱氢酶基因（SDH5）并结合优化还原性TCA循环，使琥珀酸（SA）产量达到111.9 g/L，产量为0.79 g/g葡萄糖。衣康酸（IA）的生产则通过异源表达顺乌头酸脱羧酶（CAD）基因并结合阻断竞争途径（如乙醛酸循环和脂质积累），在50升生物反应器中实现了94.8 g/L的高产量。α-酮戊二酸（α-KG）的产量通过过表达丙酮酸脱氢酶复合体（PDHC）和优化硫胺素补充策略，达到186 g/L。柠檬酸（CA）和异柠檬酸（ICA）是解脂耶氏酵母的天然产物，通过过表达线粒体柠檬酸合酶（CIT1）或乌头酸酶（ACO1）可以调控CA/ICA的比例，提高目标产物的产量。
甲羟戊酸（MVA）途径衍生物
解脂耶氏酵母拥有完整的内源MVA途径，是生产萜类化合物的理想宿主。通过过表达限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR1）、优化前体供应（如乙酰辅酶A）和阻断竞争途径（如角鲨烯环氧酶ERG1），并结合发酵工艺优化，实现了多种萜类的高效生产。角鲨烯产量通过多基因组合调控达到51 g/L。法尼烯（α-和β-）的产量通过引入优化的法尼烯合酶（FS）和强化MVA途径，分别达到25.55 g/L和35.2 g/L。类胡萝卜素方面，通过异源表达八氢番茄红素合酶（crtB）、八氢番茄红素脱氢酶（crtI）和番茄红素环化酶（crtYB）等基因，并优化脂质储存能力，β-胡萝卜素产量高达6.5 g/L，番茄红素产量达745 mg/L。此外，芳樟醇、柠檬烯等单萜的产量也通过类似策略得到显著提升。
磷酸戊糖（PPP）途径与莽草酸途径衍生物
PPP途径为核苷酸和芳香族氨基酸合成提供前体。通过改造该途径，解脂耶氏酵母能高效生产赤藓糖醇，产量最高达256 g/L。莽草酸途径则连接PPP与多种芳香族天然产物的合成。通过引入酪氨酸氨裂解酶（TAL）和优化代谢流，实现了对香豆酸（p-CA）的生产。进一步延伸该途径，结合细胞色素P450酶（如黄酮-6-羟化酶SbF6H）和糖基转移酶，成功合成了黄芩素（scutellarin，0.7 g/L）、二氢槲皮素（DHQ，4.2 g/L）和樱花素（sakuranetin，687 mg/L）等高价值黄酮类化合物。此外，通过强化莽草酸途径和埃利希途径（Ehrlich pathway），2-苯乙醇（2-PE）和violacein等芳香族化合物的产量也得到提升。
脂肪酸生物合成途径衍生物
作为产油酵母，解脂耶氏酵母在脂肪酸及其衍生物生产方面具有天然优势。通过表达具有特定链长选择性的硫酯酶（TE），可以生产中链脂肪酸（MCFA）。通过表达脂肪酸延伸酶（如KCS）和去饱和酶（如FAD2），并结合β-氧化途径的敲除（如PEX10），能够生产超长链脂肪酸（VLCFA），如神经酸（nervonic acid，产量17.3 g/L）。通过异源表达脂肪酸偶联/去饱和酶（如PgFADX）和优化磷脂酰胆碱（PC）池，可以生产共轭脂肪酸（如石榴酸，punicic acid）和环丙烷脂肪酸。此外，通过表达脂肪酸酰基辅酶A还原酶（FAR），可以将脂肪酸转化为脂肪醇，产量达5.75 g/L。利用其强大的脂质组装能力，还能生产可可脂替代品（CBE）和人乳脂肪替代品（HMF）。
发酵技术的创新
发酵工艺的优化对实现解脂耶氏酵母的工业化至关重要。连续发酵和灌流发酵等高密度培养技术能够显著提高生产强度和体积产率。例如，两阶段连续发酵使Omega-3脂肪酸的生产率提高了80%。人工智能（AI）和机器学习（ML）技术在过程监控、参数优化和预测模型中发挥着越来越重要的作用。基于人工神经网络（ANN）的软传感器可以实时预测细胞干重、底物消耗和产物形成，有助于实现精准控制。机器学习模型还能分析大量发酵数据，识别影响产物产量的关键因素（如pH、溶氧、碳氮比），为工艺优化提供指导。
结论与未来挑战
解脂耶氏酵母凭借其独特的代谢特性、强大的遗传操作工具箱和卓越的环境耐受性，已成为合成生物学和工业生物技术领域一颗耀眼的明星。过去十年的研究在代谢途径解析、菌株构建和工艺开发方面取得了显著成就。未来，结合人工智能引导的理性设计、新型发酵模式（如共培养系统）以及对更广泛废弃原料的利用，将进一步释放解脂耶氏酵母的潜力，推动可持续生物制造的进程。然而，副产物的形成、下游分离纯化的挑战以及转基因生物（GMO）法规限制仍是其大规模商业化需要面对和解决的关键问题。
