《Cancer Letters》：Inhibition of PRMT5-Dependent YAP Methylation Attenuates Tumorigenicity and Radioresistance in Glioblastoma
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YAP过度激活通过PRMT5介导的R124对称二甲基化阻断LATS磷酸化，促进核转位及转录活性，形成甲硫氨酸依赖的反馈环路，放疗激活该通路，抑制后可增强放疗疗效，为胶质母细胞瘤治疗提供新靶点。
梅罗|吴世宇|黄晨欣|郑子远|夏晓曦|李永华|周晓|洪世洪|钟荣辉|李伟杰|王博涛|程世元|姜晓冰|李俊俊|黄天志
中国福建省厦门市厦门大学医学院和生命科学学院，妇产科，细胞应激生物学国家重点实验室，邮编361102
摘要
转录共激活因子YAP的过度激活是Hippo通路下游的效应因子，已被证实与包括胶质母细胞瘤（GBM）在内的人类癌症的发生和发展有关，但其潜在机制仍不明确。在本研究中，我们发现甲硫氨酸通过PRMT5介导的对五个保守的LATS靶标基序（HXRXXS）中精氨酸残基的对称二甲基化（sDMA）来促进YAP的激活，其中R124被确定为主要的修饰位点。R124的sDMA（R124me2s）作为一种生理保护机制，可防止LATS在YAP的Ser127位点进行抑制性磷酸化，从而促进YAP向细胞核的转移并增强其转录活性。此外，YAP R124的sDMA通过一个前馈循环驱动GBM的甲硫氨酸依赖性和肿瘤发生性，该循环中YAP上调PRMT5和甲硫氨酸转运蛋白SLC3A2/SLC7A5的表达。进一步研究表明，辐射可以激活PRMT5-YAP-SLC3A2/7A5轴，从而促进GBM细胞的存活。联合使用放疗抑制这一信号通路可抑制颅内异种移植瘤的生长，显著延长受治疗动物的存活期。总体而言，我们的发现揭示了一个先前未被认识到的调控轴，即PRMT5介导的R124me2s通过反馈机制调控YAP的激活，为GBM的治疗提供了新的靶点。
引言
Hippo通路是一种从果蝇到哺乳动物都保守的信号级联反应，通过激酶介导的磷酸化事件来调控包括干细胞维持、器官大小控制和组织稳态在内的基本生物过程[1]、[2]、[3]、[4]。该通路的核心成分包括哺乳动物核心激酶MST1/2、支架蛋白SAV1、LATS1/2激酶及其调控亚基MOB1A/B以及最终效应因子YAP/TAZ。基于磷酸化的调控一直是控制YAP的主要方式。LATS激酶在五个保守的HXRXXS基序上对YAP进行磷酸化[5]，其中两个位点的磷酸化导致不同的命运：Ser127的磷酸化形成14-3-3结合位点，使YAP滞留在细胞质中；而Ser381的磷酸化则标记YAP以进行泛素介导的降解[6]、[7]。未磷酸化的YAP可以转移到细胞核中，并通过与伴侣蛋白（特别是DNA结合的TEAD（TEA结构域）转录因子）结合来激活基因转录[8]、[9]。YAP的激活在多种人类癌症中普遍存在，并常与异常的细胞增殖、肿瘤发生和对治疗的抵抗性相关[10]。胶质母细胞瘤（GBM）是最常见且恶性程度最高的原发性脑肿瘤，其恶性特征主要归因于一种称为GBM干细胞的干细胞群体。这些细胞具有自我更新能力，并参与了肿瘤的发生和治疗抵抗[11]。无论GBM亚型如何，YAP/TAZ都被认为是定义GBM干细胞群体的关键转录因子[12]。值得注意的是，大多数YAP过度激活的肿瘤在Hippo通路成分上没有遗传突变[13]、[14]。然而，导致YAP致癌激活的机制仍大部分尚未阐明。
恶性肿瘤会经历深刻的代谢重编程，以维持不受控制的增殖、克服微环境压力并逃避免疫监视[15]。在癌症代谢的新特征中，必需氨基酸甲硫氨酸最近被视为一个关键的代谢节点[16]。值得注意的是，与正常细胞相比，GBM干细胞和其他癌干细胞表现出显著的甲硫氨酸依赖性[17]、[18]、[19]、[20]。甲硫氨酸由甲硫氨酸腺苷转移酶2A（MAT2A）转化为S-腺苷甲硫氨酸（SAM），这是一种参与多种转甲基化反应的通用甲基供体。虽然甲硫氨酸已知可以促进癌细胞的增殖[21]、[22]、[23]，但其导致人类癌症中甲硫氨酸依赖性的机制及其与治疗抵抗性的关系仍大多未被探索。
蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMTs）是一类催化精氨酸残基上胍基团单甲基化和二甲基化的酶，使用S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体。二甲基化有两种形式：不对称二甲基化（aDMA），其中一个甲基基团添加到胍基团的末端氮原子上；或对称二甲基化（sDMA），两个甲基基团分别添加到两个末端氮原子上[24]。生成大部分aDMA和sDMA的主要酶分别是I型PRMT1和II型PRMT5。PRMT1和PRMT5具有共同的底物，特别偏好组蛋白4的精氨酸3位点以及RGG/RG基序，这些基序主要存在于RNA结合蛋白中。值得注意的是，这两种酶在癌细胞中表达显著升高；这种表达上调与不良预后相关，因此它们成为有前景的治疗靶点[25]。当PRMT1或PRMT5被抑制时，底物会被清除，导致sDMA和aDMA的水平分别增加[26]。这种补偿机制可能成为细胞的生存策略。
越来越多的证据表明，Hippo-YAP通路是一个关键的代谢传感器，能够响应葡萄糖、脂肪酸和激素信号，并反过来调节糖酵解、脂质生成和谷氨酰胺分解等关键代谢过程[21]、[27]、[28]。这使得YAP成为协调营养供应与细胞增殖和组织稳态的关键分子枢纽。然而，氨基酸代谢与Hippo-YAP信号通路之间的机制联系仍不清楚[21]、[29]。我们的研究表明，PRMT5通过LATS靶标基序（HXRXXS）中的R124位点的sDMA介导甲硫氨酸诱导的YAP激活。这种R124me2s修饰可以抵消LATS在S127位点对YAP的磷酸化，促进YAP向细胞核的转移和转录活性。重要的是，我们发现了一个正反馈循环，其中YAP诱导PRMT5和甲硫氨酸转运蛋白SLC3A2及SLC7A5（LAT1）的表达，使癌细胞能够感知和适应甲硫氨酸的可用性。此外，辐射可以激活这一通路，从而增强癌细胞的存活能力。破坏这一通路显著提高了GBM异种移植瘤模型中放疗的细胞毒性效果。
材料与方法
本节的详细信息请参见补充材料。
甲硫氨酸诱导的YAP激活依赖于SAM
为了研究氨基酸是否调控Hippo-YAP信号通路，我们在完全缺乏氨基酸的培养基（-AA）中培养GBM细胞，并通过YAP介导的TEAD4报告基因来监测YAP的活性，同时分析YAP下游靶基因（CTGF和CYR61）的表达水平以及YAP蛋白的亚细胞定位。我们的研究发现，-AA条件显著降低了YAP的转录活性，减少了靶基因的表达，并抑制了
讨论
本研究确定PRMT5是主要介导YAP在五个LATS激酶靶标基序（HXRXXS）中保守精氨酸残基上发生sDMA的酶，其中R124是主要的修饰位点。R124me2s在体外和体内都能阻止LATS对YAP在p-S127位点的磷酸化，而R124K突变体显著降低了YAP的核定位和转录活性。此外，甲硫氨酸还能刺激YAP的激活
CRediT作者贡献声明
程世元：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，资源提供，数据分析。姜晓冰：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，资源提供，数据分析。吴世宇：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，项目管理，方法学研究，数据分析，数据管理。钟荣辉：方法学研究，数据分析。李伟杰：方法学研究，数据分析。周晓：方法学研究，数据分析。洪世洪：方法学研究，
数据可用性声明
支持本研究结果的数据可向通讯作者索取。
竞争利益声明
? 作者声明以下财务利益/个人关系可能被视为潜在的竞争利益：黄天志报告了行政支持、文章发表费用、设备、药物或用品的提供，以及统计分析的支持，这些均由国家自然科学基金提供。黄天志还报告了文章发表费用、设备、药物或用品的提供，以及统计分析的支持，这些也由科学技术创新委员会提供。
致谢
我们衷心感谢厦门大学的周大旺教授、刘波教授、陈航志教授和王波教授在分享质粒和抗体方面提供的慷慨支持。本研究得到了国家自然科学基金（项目编号82273469；32470752，资助人T.H.）；深圳市科学技术和创新委员会（项目编号JCYJ20220530143406014、JCYJ20250604122933044，资助人T.H.）；以及传染病疫苗国家重点实验室科学研究基金的支持。
