《Carbohydrate Polymers》：Mutations in PilZ domains of newly discovered bacterial β-(1,3;1,4)-mixed linkage glucan synthases modulate polysaccharide production
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本研究针对细菌β-(1,3;1,4)-混合键葡聚糖（MLG）合成酶多样性不足及活性调控机制不明的问题，通过异源表达筛选发现两种新型MLG合成酶（CnGT2/CcGT2），但其活性显著低于已知酶RiGT2。进一步通过定点突变和结构模拟揭示PilZ结构域中DxSxxG/NxSxxG基序的差异是影响c-di-GMP结合和酶活性的关键，为优化微生物合成平台提供了理论依据。
在生命科学领域，多糖作为生物体重要的结构组分和功能分子，其合成机制一直是研究热点。其中，β-(1,3;1,4)-混合键葡聚糖（Mixed Linkage Glucan, MLG）是一种由β-1,4-和β-1,3-糖苷键交替连接形成的线性葡萄糖多聚物，广泛存在于谷物（如燕麦、大麦）细胞壁以及部分细菌中。MLG因其独特的理化性质（如增稠性、发酵性）和健康益处（如降低胆固醇、改善血糖控制）而备受关注。然而，相较于植物来源MLG的深入研究，细菌MLG合成酶（属于糖基转移酶家族2，GT2）的多样性、催化机制及活性调控仍知之甚少。此前，仅从Romboutsia ilealis (RiGT2) 和Clostridium ventriculi 中鉴定出少数MLG合成酶，其活性调控，特别是与第二信使环二鸟苷酸（c-di-GMP）相关的PilZ结构域的作用，尚不明确。这限制了利用工程微生物高效生产MLG的应用潜力。因此，发掘新型细菌MLG合成酶并阐明其调控机制，对于开发高效的MLG微生物生产平台至关重要。本研究发表于《Carbohydrate Polymers》，旨在填补这一空白。
为开展本研究，研究人员主要应用了以下关键技术：利用NCBI BLAST进行同源序列筛选和系统发育分析；构建低葡聚糖酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）工程菌株LoGSA进行目标基因的异源表达及功能验证；通过高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测（HPAEC-PAD）和线性离子阱质谱联用激光光学衍射电子激发解离（LODES/MSn）技术对酶促产物（MLG寡糖）进行定性和定量分析；采用定点突变技术探究PilZ结构域关键基序（D/NxSxxG）的功能；利用AlphaFold 3进行蛋白质结构预测，并与已知晶体结构（如CsBcsA）比对分析潜在调控机制。
3.1. 通过系统发育分析、序列比对和二级结构预测筛选MLG合成酶候选物
研究人员以R. ilealis GT2 (RiGT2) 为模板进行BLAST同源搜索，从Top 30同源序列中，依据序列一致性（>30%）、保守基序（如D,D,D, QxxRW, FxVTxK, RxxxR, D/NxSxxG）的存在以及跨膜拓扑结构与RiGT2的相似性，筛选出9个GT2同源酶候选物，分别来源于Anaerostipes excrementavium, Clostridium bornimense, Clostridium cuniculi (CcGT2), Clostridium nigeriense (CnGT2), Clostridium spiroforme, Fournierella pullistercoris, Leptolinea sp. HRD-7, Niameybacter massiliensis 和 Zhenhengia yiwuensis。
3.2. 大多数GT2同源物成功导入LoGSA宿主系统
将9个候选GT2基因在LoGSA酵母中进行异源表达，并通过全细胞荧光检测和凝胶内荧光分析证实了除FpGT2外的8个候选物均成功表达GFP融合蛋白，FpGT2因未检测到表达而被排除后续实验。
3.3. 裂解酵母细胞酒精不溶性残基的寡糖分析鉴定出两种MLG合成酶
对表达各候选酶的酵母细胞提取酒精不溶性残基（AIR），经地衣酶（lichenase）消化后，通过HPAEC-PAD分析，发现仅有CnGT2和CcGT2能产生MLG特征性DP3（G4G3G）寡糖，但其产量远低于阳性对照RiGT2（低约186倍）。进一步通过PGC-HPLC分离和LODES/MSn鉴定，确认了CnGT2和CcGT2产物中包含MLG DP3和DP4 (G4G4G3G) 寡糖，同时也检测到内源性β-1,3-葡聚糖片段。
3.4. CnGT2、CcGT2和R. ilealis GT2中PilZ结构域D/NxSxxG基序的定点突变影响多糖产量
鉴于CnGT2和CcGT2活性远低于RiGT2，且三者PilZ结构域中c-di-GMP结合关键基序D/NxSxxG存在差异（CnGT2/CcGT2为DxSxxG，RiGT2为NxSxxG），研究人员进行了定点突变。结果显示，将CnGT2 (D544N) 和CcGT2 (D545N) 的Asp突变为Asn后，其MLG DP3产量分别提高了8.2倍和6.3倍；而将RiGT2 (N545D) 的Asn突变为Asp后，产量略有下降。丙氨酸突变（D/N→A）则导致活性显著丧失或降低。这表明D/NxSxxG基序对MLG合成酶活性具有关键调控作用。
3.5. CnGT2的AlphaFold 3模型与CsBcsA比较提示配体与蛋白质间存在替代相互作用
通过AlphaFold 3预测了CnGT2、CcGT2和RiGT2的结构，并与实验测定的纤维素合成酶CsBcsA (PDB: 4P00) 的PilZ结构域进行比对。发现尽管MLG合成酶保留了c-di-GMP结合口袋的大部分关键残基（如RxxxR），但口袋内的多个残基存在差异（例如，CsBcsA的Gln578在CnGT2中为Ile514，Ser613在CnGT2中为Thr548）。这些差异，尤其是D/NxSxxG基序的差异，可能改变了结合口袋的微环境，影响了c-di-GMP的结合特异性或亲和力，从而可能允许其他配体（如c-GMP, c-AMP）激活酶活性，这或许解释了MLG合成酶在缺乏c-di-GMP的酵母系统中仍能保持活性的原因。
本研究成功鉴定了两种新的细菌MLG合成酶CnGT2和CcGT2，但其天然活性较低。通过深入的分子机制探索，揭示了PilZ结构域中D/NxSxxG基序的单氨基酸差异（天冬氨酸/天冬酰胺）是调控MLG合成酶活性的关键开关。将低活性酶的DxSxxG基序突变为NxSxxG可显著提升多糖产量。结构模型分析表明，这种差异可能导致c-di-GMP结合口袋的特异性改变，为酶活性的“组成型”或“替代配体激活”提供了结构基础。该研究不仅拓展了对细菌多糖合成酶多样性及调控机制的认识，更重要的是为通过理性设计（如定向进化或结构引导的突变）优化GT2家族酶活性、构建高效微生物细胞工厂以生产具有重要应用价值的MLG及其他多糖提供了新的靶点和理论依据。
