《Food and Chemical Toxicology》：Co-exposure to benzoic acid and acesulfame K synergistically induces nephrotoxicity through the CTNNB1/STAT3 axis
马玉峰|梅新月|范文曦|孙雪|何永森|张洁璐|王天宝|左毅|张婷婷|卢俊
四川省中医药大学药学院中药种质资源创新与高效利用重点实验室，中国成都
摘要
苯甲酸（BA）和阿斯巴甜（ACE）是常见的食品添加剂，但它们联合使用的肾毒性风险尚未得到充分了解。通过网络毒理学、分子模拟和体外实验，我们系统评估了它们单独及联合使用对肾毒性的影响。计算预测表明，这两种化合物均具有肾毒性潜力，其作用靶点主要集中在“对外来物质反应”和代谢紊乱等通路中。蛋白质-蛋白质相互作用网络分析确定CTNNB1和STAT3分别为BA和ACE的核心靶点，分子模拟结果证实了它们之间的稳定结合。体外实验显示，苯甲酸单独使用可抑制HK2细胞的增殖并下调β-连环蛋白（由CTNNB1编码）的表达；阿斯巴甜单独使用并未显著抑制细胞增殖，但能激活STAT3信号通路。值得注意的是，两者联合使用表现出显著的协同抗增殖效应，这一效应源于双重机制：苯甲酸通过抑制CTNNB1/β-连环蛋白通路损害肾脏 tubular 的修复能力，而阿斯巴甜通过激活STAT3通路加剧炎症和损伤反应，从而同时影响肾脏的修复功能并加重损伤。本研究首次揭示了苯甲酸和阿斯巴甜可能通过CTNNB1/STAT3信号通路协同诱导肾毒性，为混合食品添加剂的系统性安全性评估提供了新的科学依据。
引言
食品添加剂在确保食品质量和可及性方面发挥着不可或缺的作用（Li等人，2022年）。然而，目前食品安全研究中仍缺乏对其联合使用安全性的评估。现有的毒理学评估方法主要基于单个化合物的风险评估，无法充分反映日常饮食中长期、低剂量接触多种添加剂的实际情况。这种混合暴露可能导致毒理学相互作用，从而产生叠加或协同效应，带来潜在的健康风险，亟需进行系统研究。
苯甲酸（BA）是一种常用的防腐剂，广泛应用于碳酸饮料和各种调味品中（Heydaryinia等人，2011年）。虽然在规定范围内被认为是安全的，但长期或过量摄入可能增加身体的代谢负担。研究表明，苯甲酸主要在肝脏中代谢为马尿酸并通过肾脏排出，这一过程可能影响肾功能（Tang等人，2021年）。动物实验还表明，苯甲酸可能对肝肾组织造成组织病理学损伤（Ibama等人，2025年）。随着全球减少糖摄入的趋势，人工甜味剂阿斯巴甜（ACE）的使用日益普遍（Ozer等人，2013年）。尽管阿斯巴甜被归类为一般安全物质，但最新研究表明，即使在安全摄入范围内，长期摄入也可能带来不良健康影响（Debras等人，2022年；Kamanzi Ntakirutimana，2025年）。值得注意的是，苯甲酸和阿斯巴甜在实际应用中经常同时使用，例如许多常见碳酸饮料中都含有这两种成分（Ozer等人，2013年）。这导致消费者不可避免地同时接触这两种添加剂。因此，一个关键的科学问题是：在这种共存状态下，它们对肾脏的影响仅仅是叠加效应，还是会引发协同毒性？
肾脏作为主要的排泄和代谢器官，对外来物质极为敏感。肾 tubular 上皮细胞具有活跃的代谢功能和线粒体依赖性，容易受到外部化学物质的干扰，这可能引发炎症、纤维化或修复机制受损（Zhang等人，2020年）。如果食品添加剂组合使用会破坏肾脏细胞的稳态或修复过程，可能会显著增加肾脏损伤的风险，从而可能导致急性损伤发展为慢性病理，这是一个需要重视的公共卫生问题。
为系统揭示这些复杂相互作用的机制，需要能够全面分析多靶点和多通路效应的研究方法（Lehn等人，2026年；Zhang等人，2026b年）。网络毒理学通过整合靶点预测、蛋白质-蛋白质相互作用网络和通路富集分析，提供了对化学化合物毒理特性的整体认识（Chen等人，2024年；Hopkins，2007年；Yan等人，2023年）。此外，分子对接和分子动力学模拟等技术能够在原子层面精确评估化合物与核心靶蛋白之间的结合模式和动态稳定性，为验证关键相互作用提供结构生物学证据（Tao等人，2020年）。将计算预测与体外实验相结合，可以从系统发现到功能验证建立完整的证据链，为阐明协同毒性机制提供有力方法。
基于此思路，本研究重点关注常见的食品添加剂苯甲酸和阿斯巴甜，采用网络毒理学、分子对接和动力学模拟相结合的综合性策略，并结合人类肾 tubular 上皮细胞（HK2）的实验（Cao等人，2025年）。我们旨在系统探讨它们在单独及联合使用条件下的肾毒性潜力及分子机制，特别关注潜在的协同损伤效应，并识别相关关键靶点和信号通路。这项研究旨在为苯甲酸和阿斯巴甜联合使用的风险评估提供科学依据，同时为理解其他食品添加剂的混合暴露健康效应提供方法学见解。
材料
苯甲酸和阿斯巴甜购自中国上海的Macklin公司。RPMI 1640和DMEM培养基购自美国纽约的Corning公司。3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）、十二烷基硫酸钠（SDS）、二甲基亚砜（DMSO）、甘氨酸、Tris和胰蛋白酶购自Biofroxx公司。胎牛血清（FBS）由中国上海的ExCell Bio公司提供。青霉素-链霉素和胰蛋白酶由Biofrox公司提供。
苯甲酸-阿斯巴甜组合及其肾毒性
ProTox 3.0的结果表明，阿斯巴甜可能诱发肾毒性、呼吸毒性和心脏毒性，而苯甲酸则具有潜在的肝毒性和肾毒性风险（图1A–B和图S1A–B）。进一步的ADMETlab评估也显示这两种化合物具有肾毒性倾向（图1C–D）。综合这些多维度预测结果，发现这两种添加剂在肾毒性方面存在显著协同作用。苯甲酸和阿斯巴甜诱导肾毒性的核心靶点和蛋白质-蛋白质相互作用网络
去除重复数据后进行交集分析
讨论与结论
通过结合网络毒理学、分子对接、分子动力学模拟和细胞实验的综合性方法，本研究首次系统揭示了苯甲酸和阿斯巴甜之间的潜在协同肾毒性（Lehn等人，2026年；Zhang等人，2026a）。研究还确定了CTNNB1和STAT3是这种相互作用中的关键因子，从而扩展了我们对食品添加剂联合使用引起肾脏损伤的机制理解。
首先，我们的计算机模拟
CRediT作者贡献声明
何永森：数据可视化、软件处理、数据管理。范文曦：初稿撰写、实验设计、数据分析。孙雪：数据可视化、软件处理、数据管理。马玉峰：初稿撰写、实验设计、数据分析。梅新月：初稿撰写、实验设计、数据分析。卢俊：项目监督、资金申请、概念构思。张婷婷：稿件修订与编辑、结果验证、概念构思。左毅：项目管理、方法学设计。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了四川省科技计划（2024YFFK0172）、四川省中医药管理局的科技计划（2024MS028）以及成都科技局（2025-YF09-00035SN）的支持。
