θ-纳米萃取电喷雾电离质谱动态监测枸杞果实成熟过程中的代谢演变及其品质形成机制研究

《Food Chemistry: X》：Analysis of the dynamic metabolic changes during the ripening of wolfberry ( Lycium barbarum L.) fruits by theta-nano-extractive electrospray ionization mass spectrometry

本研究针对传统代谢分析方法难以实时监测枸杞果实成熟动态的瓶颈，创新性地应用θ-纳米萃取电喷雾电离质谱技术，系统解析了枸杞果实5个成熟阶段（花后7-35天）的代谢演化规律。研究发现多胺/黄酮代谢在成熟早期被显著激活，而氨基酸代谢在晚期增强，明确了脯氨酸、γ-氨基丁酸、精氨酸和N1-咖啡酰-N10-二氢咖啡酰亚精胺等关键差异代谢物，揭示了枸杞品质形成的代谢基础，为确定最佳采收期和调控营养品质提供了理论依据。

　　

枸杞作为传统药食同源植物，其果实富含多种生物活性成分，但果实成熟过程中代谢物的动态变化规律尚未明确。传统分析技术如液相色谱-质谱联用虽能精准鉴定化合物，但样品前处理复杂、分析周期长，难以实现快速、连续的动态监测，限制了人们对枸杞品质形成机制的深入理解。

为解决这一技术瓶颈，江西中医药大学肿瘤研究中心刘英团队在《Food Chemistry: X》发表研究，首次将θ-纳米萃取电喷雾电离质谱（theta-nano-extractive electrospray ionization mass spectrometry, theta-nano-EESI-MS）应用于枸杞果实成熟代谢研究。该技术通过双通道纳米毛细管稳定引入样品和提取剂，在20秒内即可完成单个样品的质谱检测，显著提高了分析效率。

研究人员以"宁杞1号"枸杞果实为材料，分别采集花后7天（S1，膨大幼果期）、14天（S2，青果期）、21天（S3，始黄期）、28天（S4，全黄期）和35天（S5，成熟期）5个成熟阶段的样本。通过优化电喷雾电压（0.8 kV）和提取剂比例（70%甲醇），建立了稳定的theta-nano-EESI-MS分析方法，结合多元统计分析和代谢通路富集，系统揭示了枸杞成熟过程中的代谢动态变化。

3.1. 生长和生物活性成分积累

研究显示枸杞果实从S1到S5，鲜重、干重、横径和纵径均显著增加，果实颜色由绿色逐渐转变为橙红色。多糖含量在S5达到35.60 mg/g FW，较S1增加303.44%；可溶性糖在S5达到70.81 mg/g FW，增加197.12%；总酚和总黄酮含量在S5分别达到3.50 mg/g FW和2.91 mg/g FW，表明成熟过程中生物活性成分持续积累。

3.2. 枸杞果实五个成熟阶段的Theta-nano-EESI-MS分析

在正离子模式下检测到m/z 796（N¹-咖啡酰-N¹⁰-二氢咖啡酰亚精胺衍生物）、m/z 175（精氨酸）等特征离子；负离子模式下检测到m/z 191（柠檬酸）、m/z 609（芦丁）等化合物。通过二级质谱鉴定出50种化合物，包括19种氨基酸、12种有机酸、7种黄酮类、3种生物碱等。特别发现m/z 472、634、796和958对应不同糖基化程度的双咖啡酰亚精胺衍生物，其含量随成熟度增加而升高。

3.3. 多元分析和代谢特征

主成分分析和偏最小二乘判别分析有效区分了五个成熟阶段，VIP分析确定33种潜在差异代谢物，其中脯氨酸（1.67）、甜菜碱（1.53）、绿原酸（1.49）等贡献显著。火山图分析显示S5与S1相比有23种代谢物上调，6种下调。热图分析表明氨基酸和黄酮类含量随成熟度增加，有机酸和生物碱含量下降，多胺含量在S2达到峰值。

3.4. 定量分析和方法学验证

对12种化合物进行定量分析，方法学验证显示线性良好（R²>0.99），检测限为0.02-2.29 ng/mL。γ-氨基丁酸在S4含量最高（1779.16 μg/g），脯氨酸和天冬酰胺在S4达到峰值，柠檬酸和苹果酸在S3含量最高后下降，杨梅素在S4含量较S1增加869.82%。

3.5. 代谢网络和通路富集分析

KEGG富集发现13条显著代谢通路，包括丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢、精氨酸生物合成和三羧酸循环（TCA cycle）。成熟早期TCA循环增强，提供能量和碳骨架；晚期精氨酸和脯氨酸代谢上调，甜菜碱积累增强渗透保护；苯丙烷代谢激活促进黄酮类合成。

研究表明，枸杞果实成熟早期以能量代谢和有机酸积累为主，晚期转向生物活性成分合成。theta-nano-EESI-MS技术为果实品质形成研究提供了高效分析平台，在枸杞栽培优化和品质调控方面具有重要应用价值。