《Food Chemistry: X》：Computational and experimental engineering of a
Pleurotus citrinopileatus lipases: Structural insights and functional optimization to adapt the hydrolytic profile for cheese applications
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本研究针对传统动物源脂肪酶在奶酪生产中存在的伦理和风味缺陷，通过SMME策略对金顶侧耳菌脂肪酶(PCI_Lip)进行三轮理性设计，获得双突变体S163M+L302G和L302G+L305A，其pNPH/pNPP水解比率提升至11.6±1.1和10.4±1.1（野生型为0.4±0.1）。奶酪感官评价显示突变体风味接近商业酶制剂，SPME-GC-MS证实其对短中链脂肪酸水解效率显著优化，为食品工业提供新型素食友好脂肪酶解决方案。
在追求健康饮食的今天，奶酪爱好者们可能不会想到，一块醇厚的奶酪背后隐藏着一场关于酶的精密改造。传统奶酪生产依赖动物源脂肪酶（如预胃酯酶PGEs）来加速成熟过程，释放出赋予奶酪独特风味的游离脂肪酸。然而，这类酶不仅无法满足素食、清真等饮食需求，其广谱水解特性还会过度释放长链脂肪酸，导致肥皂样异味。更棘手的是，目前市售微生物脂肪酶（如米黑根毛霉脂肪酶）普遍缺乏对短中链脂肪酸的选择性，难以精准调控风味轮廓。
面对这一挑战，德国吉森大学的Lea Henrich团队将目光投向了真菌界未被充分开发的宝库——担子菌门。金顶侧耳菌（Pleurotus citrinopileatus）产生的PCI_Lip脂肪酶曾被发现能模拟PGEs的风味特性，但其水解长链脂肪酸的倾向仍会导致异味。为此，研究团队在《Food Chemistry: X》发表论文，通过计算与实验相结合的多轮酶工程策略，成功改造PCI_Lip的水解特性，为奶酪工业提供了新型定制化脂肪酶。
关键技术方法
研究采用SMME（基于AlphaFold3结构预测的分子对接、分子动力学和实验验证）框架进行理性设计。通过三轮多位点突变（涵盖F91、S163、I245、L302、L305、I529等底物通道关键残基），构建单点、双点和三点突变体库。酶活性通过pNP酯（pNPA至pNPP）光度法测定，动力学参数采用米氏方程拟合。奶酪应用实验以菲达型盐水奶酪为模型，通过SPME-GC-MS分析挥发性游离脂肪酸（vFFA），并由8人感官小组进行风味评价。
研究结果
3.1 活性位点分析
AlphaFold3模型显示PCI_Lip具有典型界面激活脂肪酶结构，含催化三联体（S213、H449、E339）和关键盖结构（A69-F91）。分子动力学模拟发现L302、L305等残基构成的隧道状底物通道是链长选择性的关键。对接实验证实C4-C18链长甘油三酯均能进入活性口袋（图3）。
3.2 与无盖脂肪酶的对比
结构对比发现离心蜡蘑（Phlebia centrifuga）来源的PCE_Lip与PCI_Lip RMSD仅0.444 ?，但缺乏盖结构且酶活极低。嵌合体实验表明PCI_Lip的盖结构对其活性和溶解度不可或缺。
3.3 多轮突变优化
第一轮单点突变中L302G突变体pNPH/pNPP比率提升至10.0（野生型0.4）。第二轮双点突变体S163M+L302G和L302G+L305A的比率进一步优化至11.6和10.4，且对pNPH的kcat/KM分别达1071 s-1·M-1和823 s-1·M-1（表2）。第三轮三点突变虽增强选择性但酶活显著下降。
3.4 奶酪应用验证
vFFA分析显示双突变体显著提升C4:0-C10:0释放量。感官评价中L302G+L305A制备的奶酪风味与商业PGE相似且皂味评分更低，S163M+L302G则呈现更强烈的辛香和羊乳风味（图7-8）。
结论与展望
本研究通过精准调控PCI_Lip底物通道的立体位阻，成功将脂肪酶水解偏好转向短中链脂肪酸。双突变体L302G+L305A在保留PGEs典型风味的同时有效抑制长链脂肪酸释放，解决了肥皂味难题。这项工作不仅揭示了担子菌门脂肪酶的结构功能关系，更为开发符合伦理需求的定制化食品酶制剂提供了新范式。未来通过发酵工艺优化和剂量调控，这类工程酶有望在帕马森等风味强烈的奶酪品种中实现产业化应用。
