利用电化学免疫传感器快速检测果汁中的Alicyclobacillus acidoterrestris：其与生长动力学和腐败潜力的相关性

《Food Chemistry》：Rapid detection of Alicyclobacillus acidoterrestris in juice using an electrochemical immunosensor: Correlation with growth kinetics and spoilagez potential

基于NiMnSe/SWNTs@PPy纳米复合材料的电化学免疫传感器检测苹果汁中Alicyclobacillus acidoterrestris并建立Logistic模型预测品质劣变，实现微生物定量检测与风味衰退的协同分析。

　　

陈玉阳|崔琪琪|刘敏轩|李佳熙|张富源|王向红

河北农业大学食品科学与技术学院，保定 071000，中国

摘要

Alicyclobacillus acidoterrestris（A. acidoterrestris）是苹果汁中的主要腐败微生物，它通过代谢产生愈创木酚（GUA），从而导致特征性的异味和浑浊。本研究建立了一种综合的质量评估方法，包括GC-IMS、相对气味活性值（ROAV）、逻辑建模、感官评估和皮尔逊相关性分析，证明了在果汁中定量检测A. acidoterrestris可以可靠地预测腐败情况。通过将抗A. acidoterrestris单克隆抗体（mAb）固定在NiMnSe/SWNTs@PPy纳米复合改性电极上，开发出一种电化学免疫传感器，实现了高灵敏度的检测（线性检测范围：10–1×10⁷ CFU/mL；检测限（LOD）：3.45 CFU/mL；回收率：97.66%–110.16%；相对标准偏差（RSD）：2.05%–6.26%）。此外，逻辑模型还使传感器能够预测果汁的风味劣化程度。这种双功能工具同时提供了A. acidoterrestris的检测和品质预测，对果汁质量控制具有显著优势。

引言

A. acidoterrestris是一种革兰氏阳性、嗜酸且耐热的产孢细菌，由于其独特的生理特性，已成为酸性果汁产品中的关键腐败微生物（Yamazaki等人，1996；Pettipher等人，1997；赵娜等人，2021）。该菌的适应性生存机制涉及ω-环己烷脂肪酸介导的膜通透性降低和结构完整性增强（Wisotzkey等人，1992；Shi、Sun、Qu、Zhou、Yue和Yuan，2021a；赵娜等人，2022），使其能够在极端酸性条件（pH 2.5–4.0）和热应力（45–70°C）下维持代谢并形成耐热孢子（Smit等人，2011）。这种耐热性使其能够通过常规巴氏杀菌过程存活（Walker和Phillips，2008；Li、Cheng等人，2025）。浓缩柑橘汁和苹果汁中的污染（Durak等人，2010a；Osopale等人，2016；Sourri等人，2022）会引起特征性的腐败现象：浑浊度增加并伴有絮状沉淀，同时产生GUA、2,6-二溴苯酚和2,6-二氯苯酚（N. Jensen和Whitfield，2003）。这些挥发性酚类代谢物赋予果汁烟熏般的异味和类似药品/消毒剂的气味，导致严重的感官劣化（Durak等人，2010b；Hünniger等人，2015；Neggazi等人，2024a）。鉴于其对果汁质量和安全性的重大影响，开发灵敏的微生物检测和预测性质量模型对于确保产品安全和减轻果汁行业的经济损失至关重要。

食品分类、新鲜度鉴定和过程质量控制是现代食品工业确保安全和质量的核心组成部分。相关研究开发了各种靶向检测技术：吴等人构建了一种便携式比色生物传感器，用于区分人工催熟和自然成熟的果实（吴等人，2025）；Zamfir等人采用了一种基于生物传感的便携式光电化学传感器来评估微生物引起的食品腐败（Zamfir等人，2025）；陈等人开发了一种双金属FeCu纳米酶传感器，用于检测食品热加工过程中的丙烯酰胺（陈等人，2025）。挥发性有机化合物（VOCs）是评估食品新鲜度、成熟度和腐败程度的关键指标（Han等人，2024；Wang、Chen和Sun，2020），而气相色谱-离子迁移谱（GC-IMS）因其高效捕获和分析VOCs的能力而被广泛应用。此外，作为A. acidoterrestris在果汁中的特征代谢物，GUA可以作为微生物代谢活性和果汁风味质量的定量标志物。迄今为止，已经建立了几种快速检测方法，例如基于铜单原子纳米酶（CuN4-G）（Niu等人，2023）和铂纳米粒子功能化的层状γ-Al₂O₃空心球（J. Sun等人，2015）的电化学传感器。更重要的是，VOCs与微生物生长之间的动力学耦合机制为食品保质期预测建模和安全评估提供了坚实的理论基础（Kise和Hayashida，1990；Koutsoumanis等人，2021；Tarlak等人，2018）。当前的研究表明，生长模型（Gompertz和Logistic）能够有效量化微生物种群动态和特定代谢产物的产生模式（Cinar等人，2021；Li、Wang等人，2025；J. H. Park等人，2025）。实证验证包括Tarlak使用Logistic模型成功模拟了Pseudomonas种群和蘑菇腐败（Tarlak等人，2018），以及Xie的团队通过Logistic和SGompertz模型揭示了Saccharomyces cerevisiae代谢与乙醇积累之间的剂量依赖关系（Xie等人，2024）。因此，上述应用为通过监测果汁中的微生物数量来预测果汁腐败奠定了坚实的研究基础，并为开发早期腐败检测的生物传感器提供了强大的技术支持。

目前传统的A. acidoterrestris检测方法存在显著限制：耗时的平板计数无法满足快速筛选的需求；基于PCR的技术尽管具有高特异性，但涉及繁琐的核酸提取流程（H. Li等人，2021；Shi等人，2024；Z. Wang等人，2014；Wang等人，2021；Yang等人，2017a）；仪器分析（GC–MS、傅里叶变换红外光谱、电子鼻）需要昂贵的仪器和专业人员（Al-Qadiri等人，2006；Concina等人，2010；Gobbi等人，2010；Pérez-Cacho等人，2011）。相比之下，电化学免疫传感器利用抗原-抗体特异性识别和电信号转导的协同机制，在快速和高灵敏度定量检测微生物方面展现出巨大潜力。此外，它们具有出色的现场适用性，为解决传统方法的局限性提供了新的方向（Hosseinikebria等人，2025；Liu、Hu等人，2018；Shin等人，2022）。碳纳米材料、金属硒化物和导电聚合物常被用作高导电电极修饰材料，以提高电化学传感器的灵敏度和稳定性。特别是碳纳米材料（例如单壁碳纳米管（SWNTs）可以通过改善电子转移效率和增加电极的比表面积来有效增强电化学传感器的响应性能（Bhardwaj等人，2017；Gu等人，2024；Mahmodnezhad等人，2025）。金属硒化物（例如NiSe（X. Wang等人，2024）、CuSe（Yaseen等人，2024）和双金属异质结硒化物（Ashokrao Jagtap等人，2024；Dong等人，2024；Song等人，2024；Zhu等人，2024）凭借其独特的电子轨道杂化特性和高效的界面电荷转移能力显著增强了电化学反应活性。导电聚合物（例如聚吡咯（PPy）、聚苯胺、聚噻吩）结合了金属/半导体的电化学特性和聚合物的机械灵活性（Dube等人，2025；Guo等人，2021）。此外，它们可以通过电化学聚合在电极表面形成均匀稳定的薄膜（Molecularly Imprinted Polymer Composites，2025；T. Xu等人，2023），这不仅为乙酰胆碱酯酶等生物分子的固定提供了理想的微环境（Pan等人，2024；Sadeghi等人，2023），还有助于金属纳米颗粒的原位生长（Lu等人，2024）。上述材料的协同应用不仅为高性能电化学免疫传感器的设计和构建提供了有力支持，也为快速灵敏地检测A. acidoterrestris奠定了可行的技术基础。

为了预测苹果汁的腐败进程，本研究利用GC-IMS可视化技术阐明了微生物劣化过程中VOCs的动态演变。建立了一种综合方法，结合感官评估、风味劣化分析、A. acidoterrestris生长动力学和GUA代谢动力学建模，以定量表征腐败过程中的风味质量劣化模式。在此基础上，为了实现快速灵敏的微生物检测，开发了一种基于NiMnSe/SWNTs@PPy有机导电复合膜的新型电化学免疫传感器，这是因为通过热溶剂方法合成的NiMnSe纳米材料与SWNTs和PPy协同作用，优化了电子转移活性位点和导电网络，显著提高了对A. acidoterrestris的检测灵敏度。通过整合逻辑生长动力学建模，我们将免疫传感器的差分脉冲伏安法（DPV）信号与GUA的ROAV定量相关联，建立了第一个用于A. acidoterrestris定量和果汁腐败预测的集成分析模型。该系统通过同步的电化学监测和质量劣化分析克服了传统检测方法的局限性。

试剂和材料

N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、O-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）和四水合锰(II)氯化物（MnCl₂·4H₂O）从Sigma-Aldrich购买。六水合氯化镍（NiCl₂·6H₂O）、二氧化硒（SeO₂、苯甲醇和单壁碳纳米管（SWNTs）从MACKLIN（中国上海）获得。牛血清白蛋白（BSA）、弗氏完全佐剂（FCA）和弗氏不完全佐剂（FIA）也均已获得。

VOCs分析

为了研究苹果汁腐败过程中的风味化合物差异，使用GC-IMS分析了VOCs。风味指纹谱提供了腐败过程中VOCs差异的全面分析（Yan等人，2025）。如图1A所示，这些谱图直观地展示了挥发性成分的变化。萜烯和酯类主要贡献了与天然果香和甜味相关的理想苹果汁风味（Aihaiti等人，2025）。

结论

本研究描述了一种双功能系统，能够检测A. acidoterrestris并实时预测苹果汁的风味质量，为全面监测果汁质量提供了可靠的分析方法。利用GC-IMS技术、风味指纹分析和PCA/OPLS-DA模型，识别出了苹果汁腐败过程中的VOCs显著变化。逻辑模型表征了A. acidoterrestris的生长动力学和GUA的代谢动力学。

伦理声明

进行感官研究不需要伦理批准。所有感官分析均在参与者的明确同意下进行。研究过程中充分尊重了参与者的权利和保密性。测试的产品是安全的。

CRediT作者贡献声明

陈玉阳：撰写——原始草稿、正式分析、数据整理、概念构思。崔琪琪：方法学、正式分析。刘敏轩：方法学、正式分析。李佳熙：方法学、正式分析。张富源：调查、正式分析、概念构思。王向红：撰写——审阅与编辑、监督、资源获取。

伦理批准

所有动物实验均按照提供的方案进行，并得到了河北农业大学动物护理审查委员会（批准编号2025057）的批准（中国河北）。

未引用的参考文献

Liu等人，2018

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了河北省教育厅科研项目（YJZ2024001）和河北省现代农业产业技术体系（HBCT2024170206）的支持。