钌(II)-芳烃配合物的生物分子相互作用机制与选择性抗肿瘤活性研究

《ACS Omega》：Ruthenium(II)-Arene Complexes: Biomolecular Binding, Thermodynamic Insights, and Selective Cytotoxicity

本文系统报道了两种新型二聚钌(II)-芳烃配合物（PNRP和PNRB）的合成、表征及生物活性。研究通过光谱学手段证实了配合物与DNA（Kb> 105M–1）和人血清 albumin（HSA）的自发结合（ΔG°为负值），并揭示了其通过氧化应激（ROS）诱导A549肺癌细胞凋亡的机制。配合物PNRB展现出优异的选择性（IC50= 31.37 μM，SI = 7.58），为开发高选择性、 redox-active（氧化还原活性）的金属抗癌药物提供了新思路。

　　

2. 实验部分

所有试剂和溶剂均为分析纯，未经进一步纯化直接使用。关键化学品如1,10-菲啰啉-5,6-二酮、N,N'-双(4-甲酰基苯基)-N,N'-二苯基联苯胺、二氯对伞花烃钌(II)二聚体、二氯苯钌(II)二聚体和醋酸铵均购自BLD Pharma（印度）。使用400 MHz Bruker DPX光谱仪记录¹H和¹³C NMR谱，以四甲基硅烷（TMS）为内标。熔点采用毛细管法测定。红外光谱（4000–400 cm^–1）使用Shimadzu Affinity FT-IR光谱仪测定。质谱分析在Shimadzu ESI-MS-4000质谱仪上进行，使用甲醇作为溶剂。紫外-可见光谱使用配备1 cm石英比色皿的JASCO V-670分光光度计记录。A549人肺癌细胞系购自印度国家细胞科学中心（NCCS），并在补充了10%胎牛血清和抗生素的DMEM培养基中培养。

2.2. 合成步骤

2.2.1. 配体合成

PNN配体通过1,10-菲啰啉-5,6-二酮与N,N'-双(4-甲酰基苯基)-N,N'-二苯基联苯胺在醋酸溶剂中，以过量醋酸铵为催化剂，回流反应30小时合成。反应进程通过薄层色谱（TLC）监测（展开剂：正己烷:乙酸乙酯 = 1:1）。合成的PNN配体在TLC上显示单一斑点（R_f≈ 0.38）。反应完成后，将混合物倒入冰水中，并用醋酸铵中和，产物沉淀析出。经过滤，并用正己烷和乙酸乙酯混合液洗涤除去残留杂质，减压干燥得到纯配体。产物为粉色粉末，收率74%，熔点160 °C，分子式C₆₂H₄₀N₁₀。元素分析结果与理论值相符。核磁共振氢谱（¹H NMR）和碳谱（¹³C NMR）、红外光谱（IR）和高分辨质谱（HRMS）数据均证实了配体的成功合成和结构。

2.2.2. 配合物PNRP的合成

PNRP配合物通过PNN配体与二氯对伞花烃钌(II)二聚体在甲醇溶剂中，室温反应4小时合成。反应进程通过TLC监测（展开剂：二氯甲烷:甲醇 = 9:1）。PNRP在TLC上显示单一斑点（R_f≈ 0.63）。反应完成后，过滤并用水和正己烷洗涤，得到暗粉色产物，收率77%，熔点高于300 °C，分子式C₈₂H₆₈Cl₂N₁₀Ru₂。元素分析、核磁共振谱、红外光谱和高分辨质谱数据均证实了配合物的形成。

2.2.3. 配合物PNRB的合成

PNRB配合物通过PNN配体与二氯苯钌(II)二聚体在甲醇溶剂中，室温反应4小时合成。反应进程通过TLC监测（展开剂：二氯甲烷:甲醇 = 9:1）。PNRB在TLC上显示单一斑点（R_f≈ 0.58）。反应完成后，过滤并用水和正己烷洗涤，得到红木色产物，收率82%，熔点210 °C，分子式C₇₄H₅₂Cl₂N₁₀Ru₂。元素分析、核磁共振谱、红外光谱和高分辨质谱数据均证实了配合物的形成。

3. 结果与讨论

3.1. 合成与表征

PNN配体及其相应的钌(II)配合物（PNRP和PNRB）均被成功合成，并通过多种光谱技术（¹H NMR, ¹³C NMR, FT-IR, HRMS）进行了充分表征，确认了其结构完整性和高纯度。

3.2. 光物理性质

在纯DMSO和1% DMSO溶液中研究了配合物的光物理性质。在250–297 nm范围内观察到归属于配体π-π*跃迁的吸收峰，在300–450 nm范围内观察到金属到配体的电荷转移（MLCT）跃迁，表明金属中心与配体之间存在有效的电子相互作用。荧光研究表明，配合物的激发波长对溶剂极性变化不敏感，显示出良好的稳定性。PNRP和PNRB在1% DMSO中的量子产率（Φ）分别为0.011和0.03。

3.3. 溶解性与亲脂性研究

PNRP和PNRB在多种有机溶剂中均表现出良好的溶解性。通过摇瓶法测定了配合物的正辛醇/水分配系数（Log P）。PNRP的Log P值为0.6030，显示其相对亲水；而PNRB的Log P值为1.133，表明其具有更高的亲脂性，这可能影响其细胞摄取和生物分布。

3.4. 稳定性研究

在磷酸盐缓冲液（PBS, pH 7.4）、谷胱甘肽（GSH）溶液和水溶液中评估了配合物在48小时内的稳定性。结果表明，两种配合物在上述条件下均未发生显著变化，证明了其在生理相关环境中的良好稳定性，这对于其作为潜在药物的应用至关重要。

3.5. DNA结合实验

3.5.1. 紫外-可见吸收滴定（与DNA）

通过紫外-可见吸收光谱研究了配合物与小牛胸腺DNA（ct-DNA）的相互作用。随着DNA浓度的增加，配合物在MLCT区域的吸收峰出现增色效应，表明配合物与DNA发生了相互作用。通过数据处理得到结合常数（K_b），PNRP和PNRB的K_b值分别为3.98 × 10⁵M^–1和3.19 × 10⁵M^–1，表明两者与DNA之间存在中等强度的结合，可能以沟槽结合模式为主。

3.5.2. 紫外-可见吸收滴定（与鸟嘌呤）

为了探究配合物与DNA碱基的特异性相互作用，进行了与鸟嘌呤的滴定实验。随着鸟嘌呤浓度的增加，配合物的吸收呈现减色效应。PNRP和PNRB与鸟嘌呤的结合常数分别为0.085 × 10⁵M^–1和1.045 × 10⁵M^–1，表明PNRB与鸟嘌呤的相互作用更强。

3.5.3. 荧光滴定（与DNA-EB竞争）

通过溴化乙锭（EB）竞争置换实验进一步研究DNA结合模式。在固定浓度的DNA-EB体系中加入递增浓度的配合物，导致EB的荧光强度显著猝灭。PNRP和PNRB的Stern-Volmer猝灭常数（K_SV）分别为9.24 × 10⁴M^–1和7.37 × 10⁴M^–1，表观结合常数（K_app）分别为5.71 M^–1和1.17 M^–1。这些结果表明配合物能够竞争性置换出与DNA结合的EB，提示其可能以部分嵌入的方式与DNA相互作用。

3.5.4. 粘度测量

通过测量DNA溶液在加入不同浓度配合物后的粘度变化来辅助判断结合模式。随着配合物与DNA摩尔比的增加，DNA的相对粘度（η/η₀）仅发生轻微变化，这与典型的沟槽结合或静电结合模式更为一致，而非经典的DNA嵌入剂所导致的显著粘度增加。

3.6. 与人血清 albumin（HSA）的相互作用研究

3.6.1. 荧光滴定（与HSA）

通过荧光猝灭实验研究了配合物与HSA的相互作用。随着配合物浓度的增加，HSA的内源性荧光发生猝灭。通过Stern-Volmer方程和双对数图分析，计算得到结合常数（K）、结合位点数（n）等参数。PNRP与HSA的结合常数（1.08 × 10⁶M^–1）高于PNRB（0.07 × 10⁶M^–1），且PNRP的结合位点数接近1，表明其与HSA以1:1的比例结合。

3.6.2. HSA的同步荧光光谱

通过同步荧光光谱研究了配合物对HSA中酪氨酸（Δλ = 15 nm）和色氨酸（Δλ = 60 nm）残基微环境的影响。结果表明，在Δλ = 60 nm时观察到的荧光猝灭更为显著，说明配合物的结合主要影响了色氨酸残基周围的微环境。

3.7. 热力学参数的测定

3.7.1. 结合亲和力（log K）、结合容量（n）和自由能（ΔG°）研究

在298 K, 308 K, 318 K三个温度下，通过荧光猝灭数据计算了配合物与HSA相互作用的结合常数（log K）、结合位点数（n）和吉布斯自由能变（ΔG°）。两种配合物的ΔG°均为负值，表明其与HSA的结合是自发过程。PNRP在不同温度下的log K值（6.49至6.03）和n值（~1.2-1.3）相对稳定。PNRB的log K值随温度升高而增加（4.48至5.95），n值也略有增加。

3.7.2. 结合焓（ΔH°）和结合熵（ΔS°）的测定

通过van't Hoff图计算了焓变（ΔH°）和熵变（ΔS°）。PNRP与HSA结合的ΔH°为负值（-1.17 × 10⁴J mol^–1），ΔS°也为负值（-0.04 × 10²J mol^–1K^–1），表明其结合主要由焓驱动，可能涉及氢键、范德华力等相互作用。而PNRB的ΔH°为正值（3.73 × 10⁴J mol^–1），ΔS°也为正值（1.49 × 10²J mol^–1K^–1），表明其结合主要由熵驱动，疏水相互作用占主导地位。

3.8. 抗氧化活性

通过DPPH自由基清除实验评估了配合物的抗氧化能力。PNRP和PNRB的IC₅₀值分别为30.2 μM和39.2 μM，优于阳性对照抗坏血酸（88.73 μM），表明两者均具有一定的自由基清除能力，其中PNRP活性稍强。

3.9. 体外细胞毒性研究

通过MTT法评估了配合物对A549人肺癌细胞和HEK293人正常肾上皮细胞的细胞毒性。PNRP和PNRB对A549细胞均表现出抑制活性，IC₅₀值分别为35.58 μM和31.37 μM。更重要的是，两者对正常HEK293细胞的毒性较低，其选择性指数（SI）分别为6.26（PNRP）和7.58（PNRB），远高于阳性对照药物顺铂（SI = 2.2）。这表明PNRP和PNRB，特别是PNRB，对癌细胞具有较好的选择性杀伤作用。

3.10. A549细胞内活性氧（ROS）生成的评估

使用荧光探针DCFH-DA检测了配合物处理A549细胞后细胞内ROS水平的变化。荧光显微镜观察显示，与对照组相比，PNRP和PNRB处理组的细胞荧光强度显著增强，表明细胞内ROS水平升高。其中，PNRB诱导的ROS生成更强，与其更高的细胞毒性相吻合。预先用谷胱甘肽（GSH）处理细胞，可以显著减弱配合物诱导的ROS信号，证实了ROS的产生是细胞内事件。ROS的过量产生被认为是配合物诱导癌细胞死亡的重要机制之一。

4. 结论

本研究成功设计合成了两种新型二聚钌(II)-芳烃配合物PNRP和PNRB。系统研究证实它们能与DNA和HSA发生自发、中等强度的结合，结合模式涉及沟槽结合和部分嵌入。热力学分析揭示了PNRP与HSA的结合以焓驱动为主，而PNRB则以熵驱动为主。两种配合物，尤其是含有苯配体的PNRB，对A549肺癌细胞表现出显著的细胞毒性，并且对正常HEK293细胞具有较高的选择性。其抗癌机制与诱导细胞内ROS生成密切相关。该工作突出了芳烃配体在调控钌配合物生物活性和选择性方面的重要性，为开发基于氧化还原活性的选择性金属抗癌药物提供了有价值的见解。