《Analytical Chemistry》：Application of the Ninhydrin Reaction for Quantification of Total Protein Contents: Establishment of Conversion Formulas
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本文系统评估了茚三酮反应（ninhydrin assay）作为凯氏定氮法（Kjeldahl）和元素分析法替代技术的可行性，通过建立ω(P) = (AA – 0.21) × 11.2（固体样本）与c(P) = (AAH – AA0) × 120（液体样本）两类换算公式，实现了对总蛋白含量的精准定量。该方法选择性高（仅与伯胺反应）、灵敏度优异（检测限0.014 mmol L–1），且规避了传统氮蛋白换算因子的局限性，为食品、饲料及生物样本的蛋白质分析提供了更可靠的解决方案。
引言：蛋白质功能多样性与定量挑战
作为细胞中最具功能多样性的分子，蛋白质在生物体内承担结构支撑、物质运输、激素调控及酶催化等关键生理功能。然而蛋白质分子量跨度大（数千至数百万道尔顿）、溶解性差异显著（水溶性/膜结合/完全不溶），且存在磷酸化、糖基化等翻译后修饰，这些特性为总蛋白含量精准定量带来巨大挑战。目前主流方法如凯氏定氮法和元素分析仅测量总氮含量，需借助经验性换算因子（如默认值6.25）推算蛋白含量，但实际应用中常因样本特异性导致显著偏差。
传统蛋白定量方法的局限性
Bradford法、Lowry法和BCA法（bicinchoninic acid assay）等基于全蛋白检测的技术虽广泛应用，但易受样本氨基酸组成影响。例如Bradford试剂主要与精氨酸残基反应，Lowry法则受肽骨架及酪氨酸、色氨酸等侧链干扰。而通过酸水解结合HPLC定量氨基酸的方法虽准确度高，但流程繁琐（需20-40分钟色谱分离）、色氨酸在酸水解中易降解，难以满足常规检测需求。
茚三酮反应的特异性优势
茚三酮反应选择性作用于伯胺基团（包括α-氨基酸和氨），不与硝酸盐、核酸等非蛋白氮组分反应，这种特性使其在复杂生物样本中更具优势。但既往研究多采用牛血清白蛋白（BSA）作为校准标准，未考虑样本间氨基酸组成差异及非蛋白伯胺化合物（NPA）的干扰，缺乏普适性换算公式。
材料与方法优化
实验选取小麦粉、大豆粉、脱脂奶粉等9类45个样本，系统比较凯氏定氮法（样本量0.2-1.6 g，410°C硫酸催化消化）、元素分析（样本量50-100 mg，950°C燃烧法）与茚三酮法的性能。水解条件优化显示：6 mol L–1盐酸（110°C, 24 h）比3 mol L–1氢氧化钠水解效率更高，且盐酸-水共沸点（108.6°C）可避免玻璃管中过度增压。以天冬酰胺为标准品（分子量接近蛋白源性氨基酸平均值），建立校准曲线（0-2.5 mmol L–1）。
固体样本换算公式的建立
通过最小化相对偏差和，推导出固体样本通用公式：ω(P) = (AA – 0.21) × 11.2。其中AA为茚三酮法测得的氨基酸含量（mmol g–1），0.21代表非蛋白伯胺本底值，11.2为换算因子（接近蛋白源性氨基酸平均分子量110 g mol–1的0.1倍换算值）。该公式在玉米粉（偏差-0.13%~0.11%）、大豆粉（偏差-1.22%~0.50%）等样本中与凯氏定氮法结果高度吻合，但蛋清样本因富含小分子氨基酸（平均分子量110.5 g mol–1）被轻微高估（+3.6%），鸡胸肉样本因大分子氨基酸占比高（平均分子量114.2 g mol–1）被轻微低估（-1.5%）。
液体样本的精准定量策略
针对液体样本（如血清），提出双测量法：c(P) = (AAH – AA0) × 120。其中AAH和AA0分别代表水解前后测得的氨基酸当量浓度（mmol mL–1）。120为动物蛋白专用因子（由平均分子量112和赖氨酸校正系数1.075推导），植物蛋白需调整为116。在人血清（45.1 mg mL–1）和牛血清（68.5-69.0 mg mL–1）检测中，与生物特法（biuret assay）偏差仅0.2%-2.8%。
方法学验证与比较优势
方法检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别为0.014 mmol L–1和0.1 mmol L–1（对应0.5 mg蛋白/样本）。日内/日间相对标准偏差（RSD）为1.2%-2.5%和2.0%。与默认换算因子法比较显示：洋葱样本用6.25因子会导致28%高估，而茚三酮法误差仅6%；蘑菇样本因几丁质干扰，传统方法误差达33%-76%，茚三酮法为13%；凝胶样本因富含脯氨酸（茚三酮不反应）偏差为-10%，但仍优于6.25因子的13%误差。
结论与应用前景
茚三酮法通过建立普适性换算公式，克服了传统氮蛋白换算因子的样本依赖性，在硝酸盐含量高的叶菜类（如芝麻菜）和复杂基质样本中展现显著优势。虽然对脯氨酸/羟脯氨酸富集样本存在检测盲区，但其设备要求低（仅需加热块和分光光度计）、试剂安全性高（无需浓硫酸），特别适合样本量少（可低至150 μg）、换算因子未知或实验室条件受限的场景，为食品、饲料及生物医学领域的蛋白质定量提供了更灵活、经济的解决方案。
