《PAIN》：Inhibition of bladder sensory afferents via intrabladder injection of adenoassociated viruses-retro–mediated Gi-DREADDs alleviates bladder overactivity and pain in mice
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这篇研究性论文探讨了利用化学遗传学技术治疗膀胱过度活动症（OAB）和慢性膀胱疼痛的转化潜力。研究团队比较了三种腺相关病毒（AAV）血清型（AAV9、PHP.S、AAV-retro）通过膀胱注射或鞘内注射递送的效率与特异性，发现膀胱注射AAV-retro能最高特异性地转导膀胱支配背根神经节（DRG）神经元。利用AAV-retro递送抑制性DREADD受体hM4D(Gi)，并在激动剂氯氮平-N-氧化物（CNO）激活下，能在体外抑制DRG神经元兴奋性，在体内显著缓解急性（辣椒素）和慢性（环磷酰胺）疼痛模型中的OAB与疼痛行为，且不影响排尿压力或导致尿潴留。这项工作为开发靶向膀胱感觉神经的精准疗法提供了重要依据。
引言
外周敏化，以背根神经节（DRG）神经元兴奋性增加为特征，在膀胱过度活动症（OAB）和间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征（IC/BPS）的病理生理学中起关键作用。靶向抑制膀胱感觉传入神经为治疗OAB和慢性膀胱疼痛提供了有前景的策略。化学遗传学能够结合激动剂精确调控神经活动，其中基于设计药物激活的设计受体（DREADDs）最为常用。腺相关病毒（AAVs）因其相对安全性和长效性，常被用作化学遗传学技术的递送载体。为促进化学遗传学方法在治疗下尿路功能障碍中的临床转化，本研究旨在从三种AAV血清型（AAV9、PHP.S和AAV-retro）和两种临床可行途径（膀胱注射或鞘内注射）中筛选最优组合，用于向膀胱DRG神经元递送抑制性DREADD——hM4D(Gi)，并评估其抑制神经元兴奋性及缓解OAB和疼痛行为的效果。
方法
本研究使用6至8周龄雌性C57品系小鼠。通过膀胱壁注射或鞘内注射递送表达荧光报告基因ZsGreen的AAV-retro、AAV9或AAV-PHP.S病毒，比较其在支配膀胱的L6–S1 DRG神经元中的转导效率和特异性。使用逆行追踪剂DiI标记膀胱特异性DRG神经元以评估转导特异性。通过免疫荧光染色、钙成像技术分别在体内外评估病毒转导和hM4D(Gi)激活对神经元功能的影响。通过排尿斑点实验、膀胱测压、Von Frey纤维测试、自发疼痛评估和旷场实验等行为学方法，在正常小鼠以及辣椒素诱导的急性疼痛模型和环磷酰胺（CYP）诱导的慢性疼痛模型中，评估hM4D(Gi)激活对排尿行为和疼痛敏感性的影响。
结果
1. 膀胱注射AAV9或AAV-retro可成功转导L6–S1背根神经节神经元
研究发现，膀胱注射AAV9或AAV-retro可成功转导小鼠支配膀胱的L6–S1 DRG神经元，而注射AAV-PHP.S则未能转导。转导效率与病毒滴度相关，在1 × 1013vg/mL时最高，AAV9和AAV-retro分别转导约20%和10%的L6–S1 DRG神经元。膀胱注射AAV9或AAV-retro也能转导同样支配膀胱的T13–L1 DRG神经元。
2. 膀胱注射AAV-retro对膀胱背根神经节神经元具有更高的转导特异性
与AAV9相比，膀胱注射AAV-retro对膀胱DRG神经元具有更高的转导特异性。两者对DiI标记的膀胱DRG神经元的转导效率均约为70%，但AAV9会转导更多不支配膀胱的DiI阴性DRG神经元，并转导肝、心、脑等其他器官，而AAV-retro则不会。此外，膀胱注射的AAV-retro还转导了膀胱壁内的外周神经末梢和脊髓浅层背角及背连合的中枢神经末梢，但未转导主要盆腔神经节中的自主神经元和脊髓中的运动神经元。
3. 膀胱注射比鞘内注射AAV-retro对膀胱背根神经节神经元的转导特异性更高
与鞘内注射相比，膀胱注射AAV-retro对DiI标记的膀胱DRG神经元具有更高的转导效率和特异性。鞘内注射会非特异性地转导不支配膀胱的L2–L5 DRG神经元。
4. 膀胱注射AAV-retro转导的背根神经节神经元类型
AAV-retro转导的DRG神经元包括小（40.85%）、中（30.99%）和大（28.17%）直径神经元。同时，它转导了表达不同标志物的神经元亚群：瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1+，60%）、降钙素基因相关肽（CGRP+，19.4%）、异凝集素B4（IB4+，28.7%）和神经丝蛋白200（NF200+，41.1%）。
5. 膀胱注射AAV-retro-hM4D(Gi)降低膀胱感觉神经元的兴奋性
利用AAV-retro向膀胱感觉神经元递送hM4D(Gi)后，体外钙成像显示，用CNO激活hM4D(Gi)可显著降低被转导神经元对高钾、辣椒素和机械敏感通道Piezo1激动剂Yoda1的反应，表明神经元兴奋性受到抑制，且此抑制效应在冲洗后仍持续。
6. 激活AAV-retro-hM4D(Gi)抑制正常小鼠的排尿频率和腹部机械敏感性，但不影响排尿压力和运动功能
在正常小鼠中，激活hM4D(Gi)可延长排尿间隔、提高排尿压力阈值、减少排尿次数、降低下腹部对Von Frey刺激的机械敏感性，但不影响峰值排尿压力、残余尿量以及旷场实验中的总运动距离，表明未引起尿潴留或影响运动功能。
7. 激活AAV-retro-hM4D(Gi)抑制辣椒素诱导的膀胱过度活动与伤害感受
在膀胱内灌注辣椒素诱导的急性疼痛模型中，辣椒素引发了OAB样行为（如排尿频率增加、单次排尿量减少）和疼痛行为（自发冻结行为增加、运动距离减少、下腹部机械超敏）。激活hM4D(Gi)能显著改善这些排尿功能障碍和疼痛行为。
8. 激活AAV-retro-hM4D(Gi)改善环磷酰胺诱导的慢性疼痛模型小鼠的膀胱过度活动与慢性疼痛
在CYP诱导的慢性OAB和膀胱疼痛模型中，小鼠表现出类似的OAB症状和疼痛行为。激活hM4D(Gi)同样能显著改善这些排尿异常，并缓解自发冻结行为和机械超敏反应。
讨论与结论
本研究证明，膀胱注射AAV-retro能特异性转导小鼠膀胱感觉神经元。利用AAV-retro递送的hM4D(Gi)可有效抑制膀胱DRG神经元，显著缓解OAB和膀胱疼痛行为，且不影响排尿压力或导致尿潴留。与AAV9和鞘内注射相比，膀胱注射AAV-retro具有更高的靶向特异性。尽管存在只使用雌性小鼠、仅评估了CNO的单一剂量效应等局限性，但本研究从转化视角出发，为利用化学遗传学技术靶向沉默膀胱感觉神经以治疗OAB和慢性膀胱疼痛提供了有力的临床前证据，显示出良好的转化潜力。
