《New Phytologist》：From recognition to response: integrated signaling pathways determining pollen acceptance and rejection in Brassicaceae
II. 自交不亲和性花粉的识别
柱头的可接受表面由众多伸长的乳突细胞构成。花粉落置后，其花粉被膜中的蛋白质和脂质与柱头表面在接触点混合，形成称为“花粉足”的特殊界面，为后续的分子识别对话建立了物理和液压连接平台。
自交不亲和性花粉的识别由高度多态性的S位点遗传控制，该位点编码在生殖组织中均表达的紧密连锁的S基因。SP11/SCR（也称为SCR）是一种位于花粉被膜中的小型、富含半胱氨酸的蛋白质。SRK（S位点受体激酶）是乳突细胞质膜中的跨膜受体激酶，作为其同源SCR配体的受体。在接触点，这种可扩散的SCR信号以其高特异性与其同源的SRK结合。SRK胞外域和SP11/SCR中的高变区（hv）是这种相互作用的关键。这种单倍型特异性的相互作用是自交不亲和反应的基础。如果花粉未被识别为自交——即SCR信号和SRK受体并非来自相同的S位点，或者其中一个或两个S决定因子发生突变或缺失——基础的亲和反应最终会促进亲和花粉的水合和穿透。
III. 基础亲和反应及其在自交不亲和反应中的“抑制”
1. 钙信号
钙离子（Ca2+）是已知调节花粉管生长的基本第二信使。在花粉-柱头相互作用过程中，观察到柱头Ca2+水平的显著动态变化，这些变化被认为与花粉的接受或拒绝相关。
在亲和授粉期间，由于Ca2+梯度在花粉管顶端区域对其生长至关重要，推测Ca2+是从乳突细胞中泵出的。用钙离子指示剂Calcium Green包被白菜和拟南芥柱头的实验显示，异交授粉后乳突表面Ca2+水平升高，但自交不亲和授粉后则无此现象。这种Ca2+的增加依赖于钙泵ACA13，因为缺乏ACA13的突变体未能表现出这种反应，导致花粉萌发受损和结实率降低。这些结果表明，ACA13介导的乳突细胞Ca2+外排对于亲和花粉的生长至关重要。
在自交不亲和授粉期间，表达钙离子探针YC3.6的拟南芥柱头乳突细胞显示出快速且大量的Ca2+内流，而亲和授粉仅引发小幅的Ca2+增加。这种内流主要由谷氨酸受体样（GLR）通道介导。glr3.7敲除突变体显示柱头Ca2+升高减弱，而施用GLR激动剂（如D-Ser, D-Glu）则提高了野生型拟南芥的胞质Ca2+水平。
因此，Ca2+信号在柱头处分叉：亲和授粉触发外排（通过ACA13）以滋养花粉，而不亲和授粉诱导内流（通过GLRs）以启动拒绝。这种Ca2+信号可能作为上游信号并与其他拒绝机制整合。
2. 亲和因子
亲和花粉的成功水合和萌发依赖于水分和亲和因子从乳突细胞中的输出。虽然亲和因子的性质仍然未知，但它们很可能是促进亲和反应的组分。据推测，这些亲和因子是通过分泌囊泡递送到柱头乳突表面的。在亲和反应中，已在甘蓝型油菜柱头乳突中观察到胞质流动和囊泡样结构。然而，在与自交不亲和花粉授粉后，这些分泌事件被特异性废除，有效地停止了对花粉粒的资源输送。因此，囊泡介导的分泌的调控是决定花粉命运的关键细胞检查点。
亲和反应中亲和因子的调控
输送亲和因子的分泌囊泡依赖于外泌复合体——一个包含八个亚基（Sec3, Sec5, Sec6, Sec8, Sec10, Sec15, Exo70, Exo84）的复合物——用于锚定到柱头乳突的质膜。活细胞成像显示，在亲和授粉期间，标记有Sec6-GFP和GFP-Exo70A1的外泌囊泡在靠近花粉粒的乳突质膜处积累，但在不亲和授粉期间则无此现象。Exo70A1的运输在其被促分裂原活化蛋白激酶3/4（MPK3/4）磷酸化后被激活。沉默Exo70A1或外泌复合体的其他亚基会损害拟南芥中亲和花粉的水合，证实了外泌复合体在亲和花粉水合过程中的囊泡运输功能。
囊泡融合进一步受磷脂酶D（PLD）调控，PLD产生磷脂酸（PA），这是囊泡与靶膜融合的关键信使。PLDα1的活性对于亲和反应中的水合和花粉管萌发至关重要。在甘蓝型油菜柱头中过表达PLDα1或外源施用PA会打破自交不亲和性，并促进不亲和花粉管长入乳突。最佳的PLDα1活性需要胞质Ca2+，表明亲和授粉诱导的Ca2+增加可能激活PLDα1以促进囊泡融合。
除了囊泡运输，乳突细胞必须维持合适的细胞内环境。乙二醛酶1（GLO1）负责解毒糖酵解的副产物甲基乙二醛（MG），被确定为另一个关键的亲和因子。过表达GLO1部分打破了甘蓝型油菜的自交不亲和性，而其沉默会降低结实率。
自交不亲和反应中亲和因子的降解
与亲和反应相反，负责输送亲和因子的分泌系统在自交不亲和授粉后的柱头乳突中被抑制。这种抑制是通过两条平行的靶向亲和因子的降解途径执行的。
其一是泛素-蛋白酶体途径。在识别自交不亲和花粉后，激活的SP11/SCR-SRK复合物触发柱头乳突中的信号事件，导致花粉拒绝。下游信号蛋白已被证明相当难以捉摸，到目前为止，只有两个SRK相互作用蛋白被证明在此反应中发挥作用：M位点蛋白激酶（MLPK）和ARM重复包含1（ARC1）E3连接酶。在不亲和授粉后，MLPK被SRK磷酸化。然后，SRK和MLPK共同磷酸化ARC1。磷酸化后，激活的ARC1重新定位于蛋白酶体，介导特定下游亲和组分（包括Exo70A1、PLDα1和GLO1）的泛素依赖性降解。GLO1的降解导致细胞毒性MG积累。敲低或敲除ARC1在甘蓝型油菜和拟南芥中均打破了自交不亲和反应，证实了泛素-蛋白酶体途径在自交不亲和花粉拒绝中的作用。
其二是自噬介导的液泡降解途径。自噬是一个主要的可诱导降解途径，参与植物发育和应激反应。该途径也在自交不亲和授粉期间被招募，自交不亲和授粉诱导自噬体在液泡中积累。关键自噬基因ATG5和ATG7的功能缺失突变体部分打破了拟南芥的自交不亲和反应。最近的工作确定外泌复合体亚基Exo84c是该途径的关键介质。Exo84c在不亲和授粉后促进其他外泌复合体亚基（如Sec6, Exo70A1）的自噬降解。exo84c敲除突变体延迟了Sec6和Exo70A1的降解。这表明外泌复合体亚基是自交不亲和反应期间自噬的直接靶标。
细胞骨架
植物细胞骨架，包括肌动蛋白丝和微管，在细胞形态维持、囊泡运输、细胞分裂、初生细胞壁组装和免疫中发挥核心作用。
在亲和授粉期间，乳突细胞迅速重组其肌动蛋白细胞骨架。在白菜中，罗丹明-鬼笔环肽染色显示，肌动蛋白束在靠近花粉粒的乳突细胞质中聚合和积累。在表达LifeAct-Venus的拟南芥中也观察到类似的肌动蛋白动态变化。这种重组在不亲和授粉期间的乳突细胞中不存在。用细胞松弛素D破坏肌动蛋白动态会抑制亲和花粉的水合和萌发，证实肌动蛋白聚合对于促进亲和反应是必需的。
这种肌动蛋白重塑的功能意义可能是双重的。首先，它可能促进囊泡运输，这是亲和因子胞吐作用所必需的。在白菜乳突中，亲和授粉诱导与顶端液泡网络相关的肌动蛋白聚合，这被认为有助于花粉水合。其次，它可能代表对花粉管穿透位点压力的机械敏感反应，类似于病原体接触位点的肌动蛋白积累。
微管也被认为参与花粉-柱头相互作用。在拟南芥中，皮层微管的方向通过影响细胞壁中纤维素微纤维的沉积来调控柱头乳突上花粉管的生长方向。KATANIN 1（ktn1）的突变体表现出紊乱的皮层微管和纤维素微纤维。这导致乳突细胞壁机械各向异性的丧失，使得亲和花粉管在乳突周围盘旋而不是穿透它们。在具有紊乱纤维素微纤维模式的衰老野生型乳突中也观察到类似的盘旋表型，证实了微管引导的细胞壁力学对于正确引导花粉管的重要性。
这种细胞骨架重塑很可能与Ca2+信号相协调。存在已确立的相互交叉对话，其中细胞骨架影响Ca2+稳态，而Ca2+信号反过来调节细胞骨架动力学。这种相互作用可以整合亲和性过程中的机械和化学信号。
IV. 柱头屏障主动抑制花粉水合和穿透
从概念上讲，除了在自交不亲和反应中抑制基础亲和反应外，柱头还施加选择性屏障，主动抑制花粉水合和花粉管进入。这些屏障由柱头信号模块维持，这些模块被特定的花粉来源的亲和信号削弱，并被特定的花粉来源的不亲和信号增强。
1. 通过内源性sRALF–CrRLK1L模块维持基础屏障
一个关键的调控节点涉及长春花受体样激酶1样（CrRLK1L）成员，如FERONIA（FER）/SIRèNE和ANJEA（ANJ），它们与LORELEI样GPI锚定蛋白1（LLG1）一起在乳突细胞表面形成受体复合物。这些复合物结合柱头自分泌的快速碱化因子23/33（sRALF23/33）肽，并在授粉前维持基础抑制性柱头屏障。sRALF–CrRLK1L相互作用通过启动涉及活性氧（ROS）积累、水通道蛋白（水通道）门控和细胞壁通透性的三条途径来维持此屏障。
活性氧积累
ROS在多种生理过程中发挥重要作用，但高水平的ROS爆发是对抗病原体的常见防御机制。在柱头中，sRALF–CrRLK1L相互作用激活下游的NADPH氧化酶呼吸爆发氧化酶同源物D（RBOHD），导致ROS的组成型积累。未授粉柱头中这种基础水平的ROS对花粉水合具有抑制作用。相应地，具有降低柱头ROS水平的fer-4突变体或rbohD突变体的柱头表现出更快的亲和花粉水合。
水通道蛋白关闭
在十字花科的干柱头上，花粉水合依赖于从柱头乳突细胞的有效水运输，这一过程由质膜水通道蛋白（如质膜内在蛋白PIPs）促进。值得注意的是，许多PIPs受胞质pH门控，在质子化时发生构象关闭。sRALF–CrRLK1L模块抑制质膜H+-ATPases（AHAs），阻止质子外排。由此产生的较低胞质pH促进了水通道蛋白（如PIP1;2）的质子化和关闭，有效地阻断了水分的释放。与此一致的是，具有较高授粉前柱头pH的ralf33突变体柱头促进了更快的花粉水合。
细胞壁重塑
花粉萌发后，花粉管必须穿透乳突细胞壁。FER和其他CrRLK1L家族成员已知对维持细胞壁完整性很重要。细胞壁屏障由更广泛的CrRLK1L模块维持，该模块涉及FER、ANJ、HERCULES1（HERK1）、CURVY1（CVY1），以及四种柱头自分泌RALF肽（sRALFs: RALF1, RALF22, RALF23, RALF33）。缺乏关键组分（如fer、cvy1、anj、herk1和ralf四重突变体）的柱头无法维持细胞壁屏障，允许种间花粉管穿透，而这些花粉管会被野生型柱头拒绝。
第二层控制涉及转录因子STIGMATIC PRIVACY 2（SPRI2）及其同源物SPRI2-like，它们促进细胞壁生物合成酶TBL40和TBL45的表达。发现SPRI2或TBL基因的突变体会损害屏障——允许种间花粉管穿透——直接表明该转录模块在授粉过程中加固柱头细胞壁。
2. 亲和花粉来源信号削弱屏障
为了允许花粉水合和穿透，柱头屏障——ROS积累、水通道蛋白关闭和细胞壁通透性——必须被削弱。这个过程由来自亲和花粉的信号触发。
降低ROS
在亲和授粉后，柱头ROS的快速减少对于成功的花粉水合和花粉管生长至关重要。亲和花粉采用至少三种策略来实现这一点。
花粉被膜来源的半胱氨酸富含肽（PCP-Bs）是花粉水合的关键调节因子。PCP-Bs与柱头RALF23/33竞争结合CrRLK1L受体，阻止RBOHD介导的ROS产生的激活，从而导致花粉水合。PCP-B肽也触发柱头中高水平的的一氧化氮（NO），NO与ROS密切相关。亲和花粉触发的柱头NO通过亚硝化作用使FER和RBOHD失活，关闭了核心的ROS产生机制。清除柱头NO会导致ROS积累并抑制亲和花粉管生长。此外，ROS稳态受几种清除酶调控。例如，在甘蓝型油菜柱头中敲除抗坏血酸过氧化物酶1（APX1）——一种解毒过氧化氢（H2O2）的关键酶——会导致亲和花粉水合延迟。
打开水通道蛋白水通道
水通道也被来自亲和花粉的信号打开。sRALFs被PCP-Bs替换会激活质膜AHA活性，从而将质子泵出乳突细胞。这提高了质膜附近的胞质pH，导致去质子化并打开水通道蛋白（PIP1/2s）。从而促进定向水流出来促进花粉水合。
松弛细胞壁屏障
一组不同的花粉来源的RALF肽（pRALFs）靶向由sRALFs–CrRLK1L模块维持的细胞壁通透性。这些pRALFs与sRALFs（RALF1, RALF22, RALF23, RALF33）竞争结合一组CrRLK1L受体（FER/ANJ/HERK1/CVY1）。这种配体转换被认为通过与富含亮氨酸重复扩展（LRX）蛋白的相互作用来修饰乳突细胞壁，使其局部可被花粉管穿透。
3. 不亲和花粉来源信号增强屏障
与亲和性相反，自交不亲和或种间授粉主动增强屏障。不亲和花粉信号（如自交花粉配体SCR或种间花粉信号SRK相互作用种间花粉信号）与柱头SRK受体的结合增强了SRK与FER之间的相互作用。这迅速激活了ROS产生途径，触发强烈的氧化爆发，不可逆地阻止不亲和花粉。实际上，向柱头喷洒ROS清除剂可有效打破自交不亲和反应，允许不亲和花粉生长，并使原本不育的自交不亲和近交系能够产生种子。
柱头ROS升高对花粉的抑制效应通过“柱头转移实验”得到证明。在该实验中，柱头用自交花粉授粉以诱导ROS升高，然后在不同时间点（0-60分钟）转移到含有ROS清除剂的培养基中。结果显示拯救效果呈时间依赖性急剧下降：立即转移（0分钟）允许约80条自交花粉管生长，但延迟15和30分钟分别将数量减少至仅42条和10条。这与未转移的自交不亲和柱头中观察到的自交花粉完全拒绝形成对比。这些结果表明，长时间暴露于高ROS水平会不可逆地阻止自交花粉在柱头上的发育。
从机制上讲，FER介导的ROS产生激活可能与更广泛的信号级联相关。在其他背景下，已知应激诱导的胞质Ca2+增加会激活NADPH氧化酶。因此，在十字花科的自交不亲和反应中，Ca2+流入乳突细胞可能是诱导ROS爆发的上游信号。
V. 结论
在十字花科中，导致花粉接受或拒绝的花粉-柱头相互作用遵循一个保守的顺序：初始信号识别之后是特定细胞反应的执行。
亲和反应通过协调柱头对水分和必需因子的供应与主动解除抑制性屏障（包括降低ROS和削弱细胞壁）来安排花粉接受。相反，不亲和反应利用平行但相反的途径，阻断这种支持性供应，同时放大抑制信号以强制执行花粉拒绝。
引人注目的是，这种信号结构并非十字花科柱头所独有，而是与罂粟科的自交不亲和系统以及植物先天免疫系统具有深刻的相似性。尽管利用不同的配体-受体对进行初始识别，但这些途径汇聚于保守的下游事件，包括Ca2+内流、ROS爆发、细胞骨架重塑和靶向运输。这种机制上的重叠表明植物采用模块化且经济高效的信号工具包来响应不同的外部刺激，无论是来自花粉还是病原体。
尽管取得了显著进展，关键问题仍然存在。自交不亲和信号如何决定性地覆盖亲和途径的分子基础仍然未知，并且各种下游细胞事件之间的交叉调控了解甚少。更全面地理解这些过程不仅对植物生物学至关重要，而且具有直接的实践重要性。自交不亲和性是育种计划中广泛用于生产F1杂交种子的工具。因此，阐明其机制将为操纵育性和改进重要经济十字花科作物的作物育种提供新策略。
