《Journal of Biological Chemistry》：Molecular mechanisms of mitochondrial AAA+ proteases
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本篇综述系统阐述了线粒体四种AAA+蛋白酶（LONP1, ClpXP, YME1L, m-AAA）在维持蛋白质质量控制（mtPQC）及细胞器功能中的核心作用。文章整合了最新结构、生物物理及细胞学证据，揭示了这些酶在ATP驱动的构象循环中识别、去折叠、转运及水解底物的分子机制。同时，深入探讨了其组装状态、亚基组成与调控输入如何微调活性，并解析了蛋白酶功能失调与神经退行性疾病、心肌病、代谢疾病及癌症等多种人类疾病的关联。最后，文章展望了通过小分子（如ONC201）及工程大分子等新兴策略调控其功能，从而为相关疾病的治疗干预提供新思路。
LONP1蛋白酶
LONP1结构域组成
人线粒体Lon肽酶1（LONP1，亦称LONP, LonHS, hLON, PRSS15）是AAA+超家族中调控线粒体蛋白质质量控制（mtPQC）的成员之一。它与大肠杆菌Lon（EcLon，最初被Alfred Goldberg称为“La蛋白酶”）具有高度序列相似性。LONP1组装为同源六聚体，具有三个不同的结构域。一个N端结构域（NTD）覆盖了近600 kDa的桶状复合体，调节蛋白质底物识别和寡聚体组装。两个高度保守的催化结构域构成了蛋白水解核心：第一个是环形的AAA+结构域，它水解ATP以去折叠并将蛋白质底物转运至蛋白水解核心；C端的蛋白酶结构域形成此核心，其内包含由保守的Lys和Ser残基组成的催化二元体，对降解至关重要。LONP1由核基因编码，表达时带有一个N端线粒体靶向序列（MTS; 残基1-114）。进入基质后，MTS被切除，产生成熟的LONP1多肽。
LONP1功能
LONP1调控参与线粒体生物学几乎所有方面的蛋白质周转，包括柠檬酸循环（TCA循环）酶、谷氨酰胺和类固醇激素生物合成途径、氧化磷酸化（OXPHOS）涉及的呼吸复合体亚基、线粒体DNA（mtDNA）转录因子以及调控线粒体自噬的信号蛋白。LONP1还通过清除基质中受损和错误折叠的蛋白质来维持线粒体蛋白质组质量。与胞质泛素-蛋白酶体系统不同，LONP1缺乏严格的底物标记机制。一种主流模型认为，其NTD对底物的识别很大程度上依赖于与底物错误折叠或受损状态相关的独特生物物理特性。LONP1的功能不仅限于蛋白酶活性，还包括对线粒体生物学至关重要的伴侣活性。此外，LONP1通过与线粒体DNA（mtDNA）直接结合来维持其完整性，并结合单链DNA，与线粒体核小体相关。
LONP1功能的结构见解
LONP1冷冻电镜（cryo-EM）研究揭示了其进行性蛋白质降解的机制。在复合体顶端表面，NTD的N端球状亚结构域（NTDGD）组装为三聚体二聚体。卷曲螺旋结构域（CCD）将NTDGD连接到LONP1复合体的桶状核心。每个CCD包含一个朝向中央孔道的棘轮指（Y394），在易位过程中插入底物残基之间以防止回滑。NTD具有高度动态性，并能以不依赖于ATP的方式变构激活LONP1的催化结构域。在无底物状态下，LONP1采用左手开放垫圈构象，ADP占据核苷酸结合裂隙。底物与NTDGD的结合诱导构象变化，通过CCD传播，促进AAA+环中的核苷酸交换。当底物从NTD通道进入AAA+结构域时，会诱导AAA+环闭合，形成围绕底物的右手螺旋阶梯。在易位过程中，六个AAA+亚基中的五个螺旋间距下降，第六个亚基作为连接螺旋间距最低和最高亚基的“接缝”。在AAA+环内，LONP1将ATP水解产生的构象变化与孔环1和孔环2中的芳香族残基（分别为Y565和Y599）的运动耦合，将底物推向蛋白酶腔室。一个 intersubunit signalling（ISS）基序（612DPEQ615）通过反式与相邻AAA+亚基的核苷酸相互作用，在LONP1亚基之间传递核苷酸状态。数十年来，理解AAA+蛋白酶（包括LONP1）底物易位的标准一直遵循由顺序的环周ATP水解驱动的严格 hand-over-hand 模型。然而，最近在易位底物时所有六个AAA+亚基均被ADP占据的LONP1结构与严格的 hand-over-hand 机制不一致。这导致了更“宽松”的 hand-over-hand 模型的提出，其中LONP1的AAA+结构域在爆发期和停留期之间切换。LONP1蛋白酶结构域在整个蛋白水解功能周期中切换构象。蛋白酶活性位点内的结构元件在活性和自抑制状态之间切换。底物进入蛋白酶结构域诱导平面C6对称性，促使蛋白酶活性位点转变为活性构象。这种蛋白酶结构域构象的调节似乎是细菌同源物中的一个保守特征，可作为防止线粒体基质中偶然蛋白质降解的另一层调控。与硼酸盐底物模拟物复合的LONP1结构表明，蛋白酶结构域激活会在蛋白酶环内部产生一个底物结合沟，带有一个疏水性底物结合口袋（S1口袋）。对LONP1体外产生的肽产物的质谱分析证实了其对P1位置疏水性残基的切割偏好。
LONP1在人类健康和治疗潜力中的意义
LONP1与多种人类疾病和病理密切相关。CODAS是一种遗传性发育障碍，由LONP1基因突变引起。这些突变主要位于编码AAA+结构域的序列中，特别是在环内的亚基界面处，破坏了ATP水解所必需的协同性，导致ATP消耗效率低下和无成效的底物易位。癌细胞具有独特的生物合成和生物能量需求，需要线粒体进行代谢重编程，从而对线粒体蛋白质组造成损伤。在许多情况下，癌细胞依赖包括LONP1在内的mtPQC调节因子来减轻基质蛋白质组的损伤。事实上，LONP1过表达已在多种癌症类型中被注意到。鉴于其多功能性，大量努力集中在理解LONP1如何从机制上支持癌细胞存活，这是其作为治疗靶点潜力的核心问题。几种LONP1蛋白酶结构域抑制剂已被表征，用于探究其清除受损蛋白质在支持癌细胞生长中的作用。这些包括obtusilactone A、(-)-sesamin、MG262、CC4和bortezomib，它们都靶向蛋白酶活性位点。然而，越来越多的证据表明，在某些癌细胞类型中，LONP1的ATP酶驱动的伴侣功能在诱导氧化应激时防止线粒体蛋白质聚集方面具有重要性，这需要超越经典正构蛋白酶抑制剂的抑制策略。唯一一类LONP1 ATP酶小分子抑制剂属于由bardoxolone（CDDO）及其衍生物组成的合成三萜类。这些化合物抑制LONP1的蛋白水解和伴侣功能，诱导线粒体蛋白质聚集和细胞死亡。尽管有效，这些抑制剂亲和力一般，并且在LONP1之外还有额外的细胞靶点。
ClpXP蛋白酶
ClpXP结构域组成
线粒体ClpXP是通过ClpX去折叠酶和ClpP蛋白酶结合形成的蛋白水解复合体。人ClpP组装为一对堆叠的同源七聚体环，形成一个340 kDa的桶状蛋白水解腔。人ClpX形成一个380 kDa的同源六聚体环，并与ClpP同轴结合，形成通往降解腔的连续通道。底物降解依赖于ClpX和ClpP之间的协调相互作用，后者受变构调节。
ClpXP功能
ClpXP过表达与哺乳动物和秀丽隐杆线虫中线粒体未折叠蛋白反应（UPRmt）的调节有关。UPRmt由线粒体前体蛋白的积累和胞质活性氧（ROS）水平升高触发，导致包括线粒体伴侣和蛋白酶在内的应激反应基因的上调。ClpXP的上调通过降解错误折叠的蛋白质和恢复线粒体蛋白质稳态来缓解蛋白质毒性应激。大多数线粒体ClpXP底物或相互作用蛋白参与氧化磷酸化和线粒体翻译。虽然ClpP单独只能降解小肽底物，但与ClpX结合后能够进行性降解蛋白质。在识别标记的底物后，ClpX开始去折叠并将多肽易位到ClpP蛋白酶中进行降解。这种机制在进化上是保守的。在革兰氏阴性菌中，共翻译添加的SsrA降解决定子标记不完全合成的多肽，由ClpXP或ClpAP降解，识别由衔接蛋白促进。我们最近发现，人线粒体ClpX识别带有磷酸化丝氨酸或苏氨酸残基的底物，但这不太可能是复合物唯一的底物识别模式。聚合酶δ相互作用蛋白（POLDIP2）是一种人ClpXP衔接蛋白，可保护ClpX免受LONP1介导的降解，并促进底物识别。POLDIP2被提议将血红素生物合成酶氨基乙酰丙酸合酶（ALAS）导向ClpX，以便被ClpXP降解。线粒体ClpX不依赖于ClpP的功能也在血红素生物合成中通过激活ALAS被报道。ClpX结合并去折叠ALAS的一个子结构，控制吡哆醛5‘-磷酸（PLP）辅因子进入活性位点。ClpP介导的蛋白水解之外的ClpX功能也涉及通过增强TFAM的DNA结合活性来维持mtDNA，从而促进mtDNA核小体的分布。在人成纤维细胞中，据报道ClpX与脂肪酸氧化（FAO）相关蛋白相互作用，其敲除增强了FAO而不改变这些相互作用蛋白的表达水平。这表明ClpX在FAO中具有独立的伴侣作用，尽管潜在机制尚不清楚。
ClpXP功能的结构见解
人ClpX中的439LGF441环通过插入ClpP亚基对之间的疏水口袋来介导复合体组装。六对七的亚基不匹配使ClpP的一个疏水口袋未被占据，这有助于底物易位。作为来自HCLR分支的AAA+去折叠酶，ClpX利用ATP水解释放的能量施加拉力，解聚底物并将其易位到ClpP中。最近一篇预印本文章中提供的细菌和人ClpXP结构有助于阐明这一机制。
