《Journal of Bioscience and Bioengineering》：Episomal maintenance of introduced plasmid with or without AMA1 sequence in the basidiomycete fungus
Pleurotus ostreatus
编辑推荐：
白腐真菌转化效率研究：构建含AMA1的pAMAHyg质粒，导入Pleurotus ostreatus后显示较高转化效率且抗性稳定，甲基化分析及Southern blot证实质粒以环状形式在真菌中稳定存在，支持担子菌中AMA1非必需但质粒仍能自主复制的结论。
作者：Daishiro Koshi、Moriyuki Kawauchi、Takehito Nakazawa、Yoichi Honda
所属机构：日本京都大学农学研究生院，地址：京都府 Sakyo-ku, Kitashirakawaoiwakecho, 606-8502
白腐菌属于担子菌门，因其独特的木材分解酶而被广泛研究，不仅在食用蘑菇领域，也在工业应用方面具有潜力。然而，为这类真菌建立高效转化系统仍然是一个重大挑战。在丝状子囊菌中，携带特定序列AMA1的质粒已被广泛用于提高转化效率。然而，其在担子菌中的功能尚未得到系统研究。在本研究中，构建了一种名为pAMAHyg的质粒，该质粒不仅包含AMA1基因，还包含来自pPHT1质粒的潮霉素B抗性标记基因。将pAMAHyg质粒导入白腐菌Pleurotus ostreatus后，其产生的抗潮霉素菌落数量比使用pPHT1质粒的菌落数量更多，尽管pAMAHyg质粒的体积较大，这表明它对转化效率有积极影响。与子囊菌中的先前研究不同，转接后的菌株在传代培养过程中并未出现抗性丧失现象。在大肠杆菌中的质粒拯救实验表明，pPHT1或pAMAHyg的环状结构及其原始序列在P. ostreatus中能够得到保持（仅有少数例外）。通过对拯救后的质粒进行甲基化敏感限制性酶分析，证实这些质粒在P. ostreatus中复制时去除了细菌的Dam甲基化修饰，并获得了CpG甲基化修饰，这与AMA1的存在无关。Southern印迹实验也证实了这些质粒已整合到真菌基因组中。综合这些结果，可以推测在P. ostreatus转化体中，整合型质粒序列与游离质粒序列可能共存。
实验部分
菌株、培养基、培养条件及遗传操作
本研究使用了Pleurotus ostreatus的单核菌株PC9（西班牙类型培养物收藏编号CECT20311）进行转化实验。菌株在含有1.5%（w/v）琼脂的酵母提取物、麦芽提取物和葡萄糖（YMG）培养基（31）上培养，培养条件为28°C、持续黑暗环境。含有100 μg/mL潮霉素B的YMG平板用于检测菌株对该抗生素的抗性（32）。
转化效率的比较（含AMA1与不含AMA1的情况）
为了评估AMA1序列对转化效率的影响，构建了一种名为pAMAHyg的质粒载体。该载体整合了来自pPTRII的AMA1基因以及来自pPHT1的hph表达基因（33）。通过比较pAMAHyg与pPHT1的转化效率，评估了AMA1的作用。pPHT1不含AMA1基因，但含有相同的hph基因作为选择标记。两种质粒分别独立导入到使用相同方法制备的P. ostreatus原生质体中（
讨论
在丝状子囊菌中，携带AMA1的质粒（最初在A. nidulans中被鉴定为ARS序列（20））是实现高效转化的有效工具（22, 23, 24, 25）。然而，担子菌中AMA1的功能尚未得到充分研究。仅有少数报道指出其潜在应用，例如在P. chrysosporium中的转化作用（29）。据我们所知，目前尚无研究定量分析AMA1的存在与否对转化效率的具体影响。
作者贡献声明
Daishiro Koshi：撰写初稿、数据可视化、方法设计、数据分析、概念构建。
Moriyuki Kawauchi：撰写、修订与编辑、数据可视化、项目监督、资源协调、方法设计、资金申请、数据分析、概念构建。
Takehito Nakazawa：方法设计、数据管理。
Yoichi Honda：撰写、修订与编辑、项目管理、数据管理、概念构建。
致谢
我们感谢Navarra公立大学的Antonio Gerardo Pisabarro教授提供
P. ostreatus菌株PC9。本研究部分得到了日本学术振兴会（KAKENHI 22H00380和22KK0090项目对Y.H.的支持）、日本学术振兴会研究员资助计划（23KJ1317项目对D.K.的支持，以及日本大阪发酵研究所（K-2019-002项目对M.K.的支持）。
