关于通腑止咳方通过TLR4/MyD88/NF-κB信号通路改善咳嗽变异型哮喘的研究

《Journal of Chromatography B》：Study on the improvement of cough variant asthma by the Tongfu Zhike formula via the TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway

咳嗽变异性哮喘小鼠模型中通府止咳方的药效学及分子机制研究，通过UHPLC-MS/MS鉴定出495种活性成分，网络药理学揭示其通过调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路发挥抗炎作用，实验证实可减少咳嗽次数、降低IgE等炎症因子水平并抑制肺部炎症细胞浸润和纤维化。

　　

杨振|李慧英|赵伟|于英霞|林彦玲|刘建轩|范星虎|王淼岩|滕鑫|邱志凯

吉林省中医药研究院，中国吉林省130012

摘要

目的

评估通腑止咳方（TFZKF）对咳嗽变异性哮喘（CVA）小鼠的治疗效果，并探讨其在改善CVA中的作用机制。

方法

使用UHPLC-MS/MS检测并分析了TFZKF的主要化学成分。通过网络药理学方法研究了TFZKF在CVA中的潜在靶点。分组给药后，观察CVA小鼠的咳嗽次数和咳嗽潜伏期。同时检测了支气管肺泡灌洗液（BALF）中的白细胞分类计数、血清IgE、IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ的水平，以及肺组织的病理变化。通过Western blot和RT-qPCR分析了CVA小鼠肺组织中TLR4、MyD88和NF-κB的蛋白表达水平和mRNA变化。

结果

在正负离子模式下，共检测到TFZKF中的495种化学成分。网络药理学分析确定了199个与TFZKF和CVA相关的潜在靶点，并发现其与TLR4和NF-κB信号通路有密切关联。动物实验表明，与模型组相比，TFZKF显著减少了咳嗽次数，延长了咳嗽潜伏期，降低了血清IgE、IL-4、IL-5和IL-13的水平，减少了BALF中的白细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞总数，减轻了肺组织的炎症细胞浸润和纤维化，并下调了TLR4、MyD88和NF-κB的蛋白和mRNA表达。

结论

TLR4/MyD88/NF-κB信号通路内的相互作用可能是治疗咳嗽变异性哮喘的关键靶点。

引言

咳嗽变异性哮喘（CVA）是一种特殊的哮喘类型。咳嗽通常在早晨和夜间发生，白天的症状较轻，夜间更为严重。其表现为反复出现的慢性干咳，尤其在体力活动后、吸入冷空气或接触刺激性气味时加剧[1]。CVA通常不伴有典型的哮喘症状，如喘息或呼吸急促，是儿童慢性咳嗽的主要原因之一[2]。CVA患者的气道对刺激物表现出高反应性，这是其病理生理机制[3]。CVA的患病率在不同地区有所差异，亚洲尤其是中国、日本和韩国的病例数最多[4]。CVA的发病机制复杂，涉及免疫失调、代谢紊乱、微生物失衡和多种信号通路的异常。研究表明，CVA的咳嗽与气道高反应性和嗜酸性粒细胞气道炎症密切相关[5],[6]。CVA患者血清中的炎症因子水平（如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、高敏C反应蛋白（hs-CRP）、白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-5（IL-5）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-13（IL-13）显著升高，尤其是在急性发作期间。对CVA患者痰液的代谢组学分析显示，精氨酸生物合成、嘌呤代谢和嘧啶代谢途径显著富集。这些代谢紊乱可能与CVA的发病机制和治疗反应有关[7]。微生物群的改变也在CVA的发病机制中起重要作用。CVA患者的肺部、回肠和结肠微生物群的相对丰度、α多样性和β多样性存在显著变化。值得注意的是，如支原体（Mycoplasma）、粪杆菌（Faecalibacterium）和瘤胃球菌（Ruminococcus）等核心微生物与白细胞介素-12（IL-12）和IL-13等炎症因子有显著相关性[8]。CVA的发病机制与多种信号通路的异常激活有关。TLR4/NF-κB和Wnt/β-连环蛋白通路在CVA中显著上调，导致炎症和氧化应激反应增强[9]。此外，p38 MAPK信号通路的异常激活与CVA中的糖皮质激素不敏感有关[10]。

CVA的发病年龄范围广泛，儿童和青少年的患病率尤为高[11]。目前有多种治疗CVA的药物。研究表明，单独使用吸入性皮质类固醇（ICS）或与长效β2-激动剂（LABA）联合使用可以显著改善CVA患者的症状和肺功能[12],[13]。对于儿童CVA患者，诊断后的前8周内，ICS和LABA联合使用是最佳治疗选择，之后可以单独使用ICS来维持症状控制[12]。然而，长期使用ICS可能对儿童的生长发育产生轻微影响，尽管这种影响通常很小。LABA可能会引起头痛、震颤和心悸等副作用[14]。近年来，越来越多的复方中药方剂通过多组分、多靶点和多通路机制显示出显著的治疗效果。例如，止嗽散通过调节白细胞介素-17（IL-17）信号通路、Th17细胞分化和TNF信号通路来缓解炎症反应[15]。黄芪心欣汤通过调节PI3K-Akt信号通路和Toll样受体信号通路发挥治疗效果[16]。

通腑止咳方（TFZKF）是我们医院儿科部门的一种临床验证的处方药。其组成基于“清肠止咳”的整体治疗原则，并已显示出显著的临床疗效。本研究利用网络药理学方法筛选TFZKF中的潜在活性成分并预测其在治疗CVA中的作用机制。随后进行了动物实验以验证TFZKF对CVA小鼠的治疗效果。进一步使用Western blot和RT-qPCR验证了预测的代谢途径，从而阐明了TFZKF在治疗CVA小鼠中的分子机制。

试剂片段

试剂

从Sigma-Aldrich购买的鸡蛋白白蛋白（10032556884）；Alhydrogel佐剂2%（H082110128）来自InvivoGen；地塞米松片（2312192）由安徽金泰阳生化制药有限公司提供；辣椒素（G1502115）购自Aladdin；嗜酸性粒细胞染色液（BA-4022）由珠海Baso生物技术有限公司提供；Wright-Giemsa染色剂（批号2312192）由Baso公司供应；PBS缓冲液（01525968AG）由...

TFZKF中化学成分的鉴定

使用UHPLC-MS/MS分析了TFZKF中的成分。通过与在线数据库（Thermo mzCloud）和本地数据库（Thermo mzVault）的比较，在正负离子模式下共鉴定出495种成分（见补充表S1和S2）。TFZKF在正负离子模式下的总离子色谱图（TIC）显示在图2A-B中。此外，基于准确的分子量测定、MS碎片化路径分析和保留时间比较...

讨论

CVA的主要特征是持续八周或更长时间的慢性咳嗽，可能伴有季节性或夜间咳嗽加重[17]。CVA还表现出气道高反应性和嗜酸性粒细胞气道炎症[18]。CVA在儿童中更为常见，因为他们的免疫系统尚未完全成熟。T辅助细胞（Th）细胞分化和调节性T细胞（Treg）功能的不足使他们更容易受到免疫细胞失衡的影响

结论

通过实验验证和理论分析，本研究证实TFZKF可以改善哮喘小鼠的临床症状并降低气道炎症水平。其机制可能与抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路有关。这为TFZKF在CVA临床应用提供了中医理论基础和实验数据支持。

CRediT作者贡献声明

杨振：概念构思。李慧英：方法学。赵伟：正式分析。于英霞：正式分析。林彦玲：数据整理。刘建轩：概念构思。王淼岩：方法学。滕鑫：资金筹集。邱志凯：研究调查。

资助

本研究得到了吉林省卫生技术能力提升项目 [资助编号2024A143]和国家级中医药传统技术专家培训计划（编号[2023]96）的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。