《Journal of Chromatography B》：A two-dimensional hyphenated ion-exchange chromatographic platform for simultaneous assessment of AAV8 capsids and impurity fingerprinting in upstream processes
编辑推荐：
本文推荐一项针对AAV基因治疗载体上游工艺监控的创新研究。为解决传统分析方法在复杂样品基质中分辨率不足、易受杂质干扰的难题，研究团队开发了二维离子交换色谱（2D CEX-AEX）联用平台，结合多检测器（UV/FL/LS）实现AAV8空壳/完整衣壳的高精度分离与杂质指纹分析。该方法无需离线纯化即可直接分析上游样品，在线捕获灵敏度达1.07×109vg/mL，空壳/完整衣壳分离分辨率达2.12，显著提升工艺监控效率，为AAV生产工艺优化提供关键质控工具。
在基因治疗领域，腺相关病毒（AAV）因其安全性高和长期表达特性成为最受欢迎的病毒载体之一。然而AAV生产工艺中，上游过程（USP）产生的样品往往含有大量空衣壳（不含基因组）、部分填充衣壳以及宿主细胞蛋白、DNA等杂质，严重影响最终产品的治疗效果和安全性。传统监测方法如ELISA、PCR和一维液相色谱（1D LC）在分析这类复杂样品时，常面临分辨率低、基质干扰强、操作繁琐等挑战。尤其当需要同时评估完整病毒衣壳比例和杂质分布时，现有技术往往力不从心。
为解决这一行业痛点，来自斯洛文尼亚Sartorius BIA Separations的研究团队在《Journal of Chromatography B》发表了一项创新研究，开发了二维联用离子交换色谱平台（2D CEX-AEX），实现了对AAV8上游样品的直接、高效分析。该平台首次将阳离子交换（CEX）捕获与阴离子交换（AEX）分析相结合，配合多波长紫外-可见光（UV-Vis）、荧光（FL）和多角度光散射（LS）检测器，无需样品前处理即可同时完成病毒衣壳定量和杂质指纹分析。
关键技术方法
研究采用AAV8载体样本（由HEK293细胞通过三重转染生产），建立二维色谱系统：第一维使用CIM? Trap SO3 monolithic柱进行样品捕获和预净化，第二维采用CIMac QA HR柱分离空衣壳（E）和完整衣壳（F）。系统集成UV（260/280 nm）、FL（Ex280 nm/Em348 nm）和LS（90°）检测器，通过在线稀释和阀切换技术实现自动化分析。方法验证涵盖线性范围（1×109-2×1011vg/mL）、检测限（1.07×109vg/mL）和精密度（RSD<1.5%），并采用数字PCR（dPCR）、质谱光散射（MP）、毛细管电泳（CE-SDS）等技术进行正交验证。
3.1. 二维色谱平台验证与功能评估
通过对比上游样品与纯化样品分析结果，证实二维方法在复杂基质中仍能保持稳定性：空壳/完整衣壳分离分辨率达2.12，完整衣壳比例测定值与正交方法结果高度一致（34% vs 33%）。CEX维度有效去除宿主DNA等带负电杂质，降低第二维分析干扰；多检测器联用提供互补信息，LS特异性识别病毒颗粒，FL敏感检测蛋白类杂质。
3.2. 二维色谱分离峰的验证
组分收集实验显示，Fr1（93-100%空衣壳）与Fr3（75-98%完整衣壳）为主峰，Fr2/Fr4为异质群体。质谱光散射显示部分填充衣壳占比低于10%，密度梯度离心（DGUC）与CE-SDS证实衣壳蛋白组成均一。二代测序（NGS）揭示Fr2中不完全基因组比例达26.97%，显著高于Fr3/Fr4（约3%），证明方法能按基因组完整性分离病毒亚群。
3.3. 方法学验证
回收率试验显示dPCR与ELSIA结果分别为103.6%和147.5%，线性相关系数R2=0.998。残留可忽略，日间/日内精密度RSD均低于1.5%，满足法规要求。与质谱法（MP）相比，检测灵敏度提升两个数量级。
3.4. 方法适用性：USP变量影响评估
分析9种不同上游条件（细胞系、转染试剂、质粒组合等）样品，显示方法耐受性良好。样品6和9的杂质信号增强（FLD面积达10,623-32,054 mVs），揭示培养基成分与质粒设计对杂质谱的影响，为工艺优化提供指纹图谱依据。
3.5. 多血清型适用性评估
将方法扩展至AAV2/5/9血清型，未优化条件下AAV2分离效果与AAV8相当，AAV9因结合力不足需调整pH，AAV5出现部分填充衣壳中间峰，证明平台具备方法迁移潜力。
结论与意义
本研究开发的二维色谱平台突破了AAV上游工艺监控的技术瓶颈，首次实现复杂样品中空壳/完整衣壳的在线分离与杂质同步分析。通过双柱协同净化与多检测器联用策略，显著提升分析效率与可靠性，为基因治疗领域提供关键过程分析技术（PAT）工具。该方法不仅适用于AAV8，经参数优化后可扩展至其他血清型，对加速工艺开发、保障产品质量具有重要应用价值。未来可进一步与实时过程控制、质量源于设计（QbD）策略结合，推动AAV生产工艺的标准化与智能化升级。
