《Journal of Chromatography B》：Comprehensive pharmacokinetics and metabolite profiling of the novel anti-tumor polypeptide CPP-4-2 in rats using UHPLC-MS/MS
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抗肿瘤多肽CPP-4-2通过竞争性结合SND1蛋白诱导其降解，抑制SND1-Metadherin相互作用，经CCK-8、集落形成和迁移实验验证其抗肝癌活性，建立涵盖描述、鉴别、检查等质量标准的HPLC方法及高灵敏UHPLC-QTRAP-MS/MS体内定量方法，证实静脉给药后0-2小时为主要药效窗口，并鉴定16种代谢产物。
作者：Anci Zhu | Shuo Ma | Juan Cao | Peng Li | Ran Liu | Bosai He
沈阳药科大学药学院，中国沈阳文华路103号，110016
摘要
CPP-4-2是一种新型抗肿瘤肽，通过竞争性结合葡萄球菌核酸酶结构域蛋白1（SND1）来干扰肿瘤生长，诱导其降解并抑制SND1与Metadherin（MTDH）的相互作用。尽管这种方法已被证实有效，但全面的体内分析方法仍较为有限。因此，基于CPP-4-2的理化特性，我们使用CCK-8、细胞增殖实验和细胞迁移实验验证了其抗肝癌活性。同时建立了包括描述、鉴定、检测及相关物质在内的CPP-4-2的质量标准，并验证了一种用于体外定量的高效液相色谱（HPLC）方法。此外，还开发了一种高灵敏度、高特异性、可重复且快速的UHPLC-QTRAP-MS/MS方法，用于体内CPP-4-2的定量分析，该方法适用于血浆、心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏组织中的生物样本分析。对SD大鼠进行静脉注射（10 mg/kg）后，该方法显示CPP-4-2的血浆浓度峰值迅速升高，随后迅速下降，表明其主要作用时间为0–2小时。通过UHPLC-Q-TOF-MS/MS鉴定了16种代谢物，包括母体化合物。本研究突出了CPP-4-2的潜力，建立了质量控制体系，提供了关键的体内数据，并为进一步的结构修饰、新型剂型的开发以及安全用药实践的研究奠定了基础。
引言
多肽是由氨基酸通过肽键连接形成的链状分子，作为蛋白质的基本结构单元和代谢中间体，在神经调节和激素信号传导等生理过程中发挥着关键作用[1]。通常含有10–50个氨基酸的化合物被定义为多肽。1902年分泌素的发现推动了多肽研究的快速发展[2]。1922年胰岛素的成功提取标志着内分泌治疗的突破。随后，多肽抗生素和合成激素（如催产素）的发展，以及固相肽合成的改进，显著提高了多肽药物的大规模生产和应用[3]。多肽药物结合了小分子和生物制剂的优点，表现出高生物活性、强特异性、低毒性和易于修饰的特性[4]、[5]、[6]。已有近200种多肽药物被批准用于治疗癌症、代谢性疾病、感染等多种疾病，使其成为新药开发的重要领域[7]、[8]、[9]。
葡萄球菌核酸酶结构域蛋白1（SND1）是一种多功能致癌蛋白，在多种癌症类型中过表达[10]、[11]。Metadherin（MTDH）是一种受c-myc蛋白调控的致癌基因，通过调节多种信号传导途径增强癌细胞的致瘤性和转移能力[12]。MTDH与SND1形成的复合物提高了这两种蛋白质的稳定性，共同促进了癌症的进展和转移[13]、[14]、[15]、[16]。针对这种相互作用，我们的实验室利用噬菌体展示技术筛选、鉴定并独立合成了新型多肽药物CPP-4-2。其氨基酸序列为Ac-RRRKKRRQRRRQFDYDHFLMWYS-NH?，分子量为3326.85 Da，等电点为12.12。CPP-4-2可竞争性结合SND1，诱导其降解，从而抑制肿瘤生长。先前的研究已证明CPP-4-2在乳腺癌细胞和小鼠模型中具有显著的抗肿瘤效果。本研究进一步探讨了其抗肝癌活性，并为后续的质量控制和药代动力学研究奠定了基础。
由于多肽分子量大、极性高且易受酶降解，其药代动力学特征与小分子药物不同[17]。多肽易被蛋白酶降解，导致口服生物利用度低，因此通常采用注射给药方式；非侵入性给药途径（如经皮、肺部）已成为制剂研究的重点[18]、[19]。分布受分子大小、亲水性和与血清蛋白（如白蛋白）的结合影响。修饰策略（如与细胞穿透肽结合）可改善组织靶向性和细胞内递送[20]、[21]。代谢主要发生在胃肠道、血液和组织中的蛋白酶作用下；其他清除机制包括靶介导的内吞作用和溶酶体降解。排泄主要通过肾脏进行，小分子肽通过肾小球过滤，大分子肽则先被酶切后再被重吸收或通过胆汁排泄。
体内多肽药物的分析面临内源性干扰强、浓度低和代谢迅速等挑战，需要高度敏感和特异的方法[22]。免疫测定（如ELISA）具有高灵敏度和操作简便性，但需要昂贵的抗体制备且容易发生非特异性结合。同位素标记可精确追踪药物分布和代谢过程；然而，同位素可用性有限、操作复杂性和安全性问题限制了其应用[23]。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）结合了高效分离和准确检测的特点，适用于复杂生物基质中多肽药物的定性和定量分析[24]、[25]，已成为药代动力学研究的首选方法。
基于CPP-4-2在乳腺癌模型中的显著疗效，本研究通过药效学实验进一步探讨了其抗肝癌活性，并建立了全面的质量控制和分析方法。开发了一种高特异性的HPLC-MS/MS方法用于生物基质中CPP-4-2的定量分析，并成功应用于大鼠静脉给药后的药代动力学行为和组织分布研究。此外，还通过UHPLC-Q-TOF-MS/MS鉴定了潜在的代谢物。这些结果为CPP-4-2的药理学评估和代谢研究提供了坚实的科学基础，为结构优化、新型制剂开发和安全用药实践提供了参考。
化学物质和试剂
本研究中使用的新型抗肿瘤多肽药物CPP-4-2由Pepmic Biology Co., Ltd.（中国苏州）采用固态合成方法制备，纯度超过95%。CPP-4-2的特定氨基酸序列为Ac-RRRKKRRQRRRQFDYDHFLMWYS-NH?，其结构如图1所示，分子量为3326.85 Da，等电点为12.12。Leuprorelin-Ac被用作内标（IS），因为它是一种外源性化合物。
定量分析条件的优化
1 mg/mL的CPP-4-2储备液用纯水稀释后，通过AB Sciex QTRAP 6500+三重四极杆质谱仪的蠕动泵输送。评估了正离子和负离子检测模式，最终选择了正离子模式。Q1的全扫描结果如图2所示，选择了响应最强的三个母体离子：[M?5H]??（m/z 666.3）、[M?6H]??（m/z 555.4）和[M?4H]??（m/z……）
结论
本研究成功建立了一种高灵敏度、高特异性、可重复且快速的UHPLC-QTRAP-MS/MS方法，用于体内新型抗肿瘤肽CPP-4-2的定量分析。优化的样品预处理方案和完全验证的生物分析方法为大分子量多肽药物的制药分析提供了可靠的框架。该方法的应用使CPP-4-2的药代动力学和组织分布研究得以全面开展。
作者贡献声明
Anci Zhu：撰写——初稿。
Shuo Ma：研究。
Juan Cao：研究。
Peng Li：验证。
Ran Liu：撰写——审阅与编辑。
Bosai He：撰写——审阅与编辑。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号：82374333）、沈阳药科大学优秀青年计划（编号：YQ202310）、辽宁省科技厅项目（编号：2025-MSLH-631）、辽宁省教育厅基金（编号：LJ212410163006）、深圳市高层次人才计划（编号：6023330007K）、深圳市科技计划（编号：20231127011819001）、广东省基础与应用基础研究基金（编号：2023A1515110004）等项目的支持。
