《Journal of Controlled Release》：Intrapericardial delivery of FAP-CAR-T cells via a ROS-responsive hydrogel to treat cardiac fibrosis
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心肌纤维化治疗中，基于ROS响应性水凝胶的FAP-CAR-T细胞局部递送系统显著提高疗效并减少副作用。该水凝胶通过硫代酮键交联聚乙二醇基质，在纤维化区域ROS高表达环境下选择性降解，精准释放靶向纤维化激活蛋白FAP的CAR-T细胞，在体内实验中有效抑制纤维化重塑并恢复心脏功能。
Bihui Cao|Manting Liu|Sainiwaer Anwaier|Xiang Long|Ting You|Zijian He|Haotao Su|Xinkui Zhang|Jiaqi Wang|Huanlei Huang|Nanbo Liu|Yujie Jiang|Hongmo Xiang|Yehuda G. Assaraf|Xiaolan Zhu|Xuelei Ma|Qi Zhao|Ping Zhu|Lu Wang
广东省心血管研究所，广东省人民医院，广东省医学科学院，南方医科大学，广州510100，中国
摘要
心脏纤维化是急性和慢性心脏疾病的共同病理特征，其特征是由于成纤维细胞激活导致细胞外基质异常积聚。尽管针对成纤维细胞激活蛋白（FAP）的嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在选择性清除激活的成纤维细胞方面显示出潜力，但由于脱靶毒性和向病变心肌的输送不足，其系统性应用仍受到限制。在这里，我们介绍了一种响应活性氧（ROS）的水凝胶，用于将FAP特异性CAR-T（FAP-CAR-T）细胞输送到心包内，以局部治疗心肌梗死（MI）后的纤维化。这种基于硫酮缩醛交联聚乙二醇基质的水凝胶能够在富含ROS的纤维化组织中选择性降解，从而实现封装的FAP-CAR-T细胞的可控释放。体外实验表明，FAP-CAR-T细胞对FAP+靶标表现出抗原依赖性的细胞毒性，而水凝胶封装的CAR-T细胞保持了强劲的增殖能力，并显示出ROS触发的释放动力学。利用小鼠MI诱导的纤维化模型，基于水凝胶的心包内输送策略增强了FAP-CAR-T细胞的浸润、持久性和效应功能，显著减少了激活的成纤维细胞，减轻了纤维化重塑，并保持了心脏结构和左心室功能。这种基于水凝胶的CAR-T免疫治疗平台提供了一种局部化、靶向和按需的策略，用于对抗心脏纤维化，可能为治疗纤维化疾病提供更广泛的转化潜力。
引言
心脏纤维化是许多心血管疾病（如高血压、心肌梗死（MI）和心肌病）发展的核心病理事件[1]。它涉及心脏成纤维细胞的激活和细胞外基质（ECM）成分的过度产生，这会增加心肌硬度，损害心脏功能，并最终导致心力衰竭[2]，[3]。尽管有大量研究致力于阐明成纤维细胞激活的分子机制，但目前可用的临床疗法仅提供有限的抗纤维化效果[4]，[5]，[6]。现有的抗纤维化治疗仍然主要依赖于非特异性抑制神经激素信号通路，这些方法无法直接消除作为核心效应细胞的激活成纤维细胞[7]。因此，特异性靶向激活的成纤维细胞对于对抗心脏纤维化具有巨大潜力。
成纤维细胞激活蛋白（FAP）是一种膜结合蛋白，在各种心脏病理中的激活成纤维细胞上大量表达，但在生理条件下在人体组织中表达极少或不存在[8]，[9]。最近的进展表明，工程化的嵌合抗原受体（CAR）免疫细胞（如CAR-T细胞、CAR巨噬细胞和CAR中性粒细胞）靶向FAP，可以显著减少纤维化并改善小鼠模型中的心脏功能[10]，[11]，[12]，[13]。这些发现共同强调了FAP作为心脏纤维化免疫治疗的高度选择性和转化相关性靶点。
然而，基于CAR的免疫疗法的系统输送存在几个限制。这些限制包括需要大量自体免疫细胞、在纤维化组织中的归巢和滞留能力差、脱靶安全性问题以及体内持久性有限[14]。为了解决这些问题，人们越来越关注利用自然体腔（包括心室、腹腔和胸腔）进行CAR免疫治疗的局部化和可控输送系统[15]，[16]，[17]，[18]。特别是心包腔，为心脏的局部药物输送提供了解剖学上的有利位置，可以实现区域性的输送并减少全身暴露[19]，[20]。考虑到心脏纤维化和炎症通常伴随的活性氧（ROS）水平升高[21]，[22]，我们假设心包内（ipc）注射一种响应ROS的水凝胶可以实现纤维化区域中活的CAR-T细胞的持续、按需和局部释放，从而改善治疗效果并减少全身不良反应。
在这项工作中，我们设计了一种可注射的响应ROS的水凝胶，能够在纤维化环境中封装并可控地释放FAP靶向的CAR-T细胞。值得注意的是，在心肌梗死后心脏纤维化的小鼠模型中，心包内注射这种FAP-CAR-T封装的水凝胶显著增强了CAR-T细胞的浸润、持久性和效应活性。这导致成纤维细胞数量和胶原沉积显著减少，心肌修复得到改善，心脏功能得以恢复（图1）。这种方法优于全身CAR-T输注和局部注射游离CAR-T细胞。这些发现突显了水凝胶辅助的CAR-T细胞输送作为控制性强、精确且有效的免疫治疗心脏纤维化平台的治疗潜力。
部分摘录
人类样本
人类心脏组织是在广东省人民医院机构审查委员会（KY2024–924-01）的批准下收集的。由于本研究为回顾性设计，因此免除了知情同意的要求。
细胞系和培养条件
HEK-293 T细胞购自美国类型培养收集中心（ATCC）。通过慢病毒转导编码小鼠FAP和荧光素酶的构建体，建立了表达小鼠FAP和荧光素酶的293 T（293 T-FAP-Luc）细胞，随后使用嘌呤霉素进行选择FAP特异性CAR-T细胞的生成和功能验证
FAP在心脏疾病中的激活成纤维细胞上选择性表达，在大多数成人组织中表达极少，使其成为免疫治疗的理想靶点[9]，[11]，[27]。根据先前的报告，我们的免疫组化分析证实了FAP在人类MI组织中的特异性表达（图S1）。基于此，我们构建了小鼠FAP来源的CAR-T细胞，该细胞包含抗FAP scFv、CD8来源的铰链区和跨膜区以及细胞内的4-1BB讨论
心肌疾病引发了一系列事件，其特征是心肌细胞广泛丢失、免疫细胞浸润和成纤维细胞激活，导致进行性心脏纤维化和不良重塑[1]。尽管已经开发了多种针对纤维化细胞或分子机制的治疗策略，但这些疗法主要只能缓解症状，而不能直接解决纤维化问题[31]，[32]，[33]。在这项研究中，我们开发了一个结合
结论
总之，我们通过将FAP靶向的CAR-T细胞与响应ROS的水凝胶结合，建立了一种用于心肌纤维化的水凝胶辅助免疫疗法。这种混合平台能够将CAR-T细胞局部化、可控且持续地输送到纤维化的心肌中。Gel-CART系统增强了FAP-CAR-T细胞的激活和记忆形成，同时减轻了细胞耗竭，从而促进了有效的成纤维细胞清除，减轻了纤维化，并最终改善了心脏修复
CRediT作者贡献声明
Bihui Cao：撰写——原始草案、可视化、验证、资源获取、方法学、研究、资金获取、正式分析、数据管理、概念构思。Manting Liu：研究、资金获取、数据管理、概念构思。Sainiwaer Anwaier：验证、研究、正式分析、数据管理、概念构思。Xiang Long：验证、研究、正式分析、数据管理、概念构思。Ting You：验证、研究、正式分析、
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（82402409，资助给B.C.）、中国博士后科学基金（2024M750591和2025T180550，资助给B.C.）、广州市科技项目（2023A04J0593，资助给M.L.）、广东省基础与应用基础研究基金（2023A1515111063，资助给B.C.）、广东省重大基础与应用基础研究项目（2023B0303000005，资助给P.Z.）、广东省杰出人才专项支持计划（2021JC06Y656，资助给
