《Advanced Science》：Bufalin Inhibits the PI3K/AKT Pathway by Targeting GTF3C4 to Impede Breast Cancer Progression
编辑推荐：
本文系统揭示了传统中药蟾酥活性成分蟾毒灵（Bufalin）通过靶向转录因子GTF3C4抑制PI3K/AKT信号通路，并重塑肿瘤微环境（TME），从而抑制乳腺癌恶性进展的作用机制。研究结合有限蛋白酶解-质谱联用（LiP-MS）、RNA测序（RNA-seq）及单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，证实GTF3C4是蟾毒灵的直接作用靶点，其高表达与乳腺癌不良预后相关。体内外实验表明，蟾毒灵可抑制细胞增殖、迁移、侵袭，诱导G2/M期阻滞和凋亡，并通过调控巨噬细胞极化（M1/M2表型转换）增强抗肿瘤免疫。该研究为乳腺癌靶向治疗提供了新策略。
1 引言
乳腺癌是全球女性发病率最高的恶性肿瘤，其高度异质性和治疗耐药性仍是临床面临的重大挑战。蟾毒灵作为蟾酥中的蟾蜍二烯羟酸内酯类化合物，在肺癌、胃癌、结直肠癌及乳腺癌中均显示出抗肿瘤潜力，但其具体作用靶点及对肿瘤微环境的影响尚不明确。本研究整合多组学技术，系统阐释蟾毒灵通过靶向GTF3C4-PI3K/AKT轴抑制乳腺癌进展的分子机制。
2 结果
2.1 蟾毒灵抑制乳腺癌细胞恶性行为
蟾毒灵以剂量和时间依赖方式抑制MDA-MB-231和MCF-7细胞增殖，其IC50在72小时降至53.01±2.75 nM（MDA-MB-231）和50.14±7.98 nM（MCF-7）。克隆形成、划痕愈合及Transwell实验表明，蟾毒灵显著降低细胞迁移、侵袭能力，并诱导G2/M期阻滞和活性氧（ROS）积累。流式细胞术检测显示凋亡率随药物浓度增加而上升。
2.2 蟾毒灵在体内发挥抗肿瘤功效
在4T1-luc原位移植瘤和MDA-MB-231裸鼠模型中，蟾毒灵（2.0 mg/kg）显著抑制肿瘤生长且未引起体重下降或肝肾功能异常。免疫组化显示Ki67、PCNA、MMP9阳性细胞减少，TUNEL阳性细胞增加。流式分析发现肿瘤组织中M1型巨噬细胞（CD86+）比例上升，M2型（CD206+）下降，提示其免疫调节作用。
2.3 蟾毒灵靶向GTF3C4蛋白与PI3K/AKT通路
通过LiP-MS技术筛选出7个潜在靶蛋白，分子对接显示蟾毒灵与GTF3C4结合能最低（-10.3 kcal/mol），形成氢键的关键位点为SER254和VAL482。RNA-seq分析发现PI3K/AKT通路是蟾毒灵作用的核心富集通路，KEGG注释中该通路关联基因数量最多。
2.4 蟾毒灵重塑肿瘤微环境
scRNA-seq从61,412个细胞中鉴定出9种细胞类型，蟾毒灵处理后上皮细胞比例增加，巨噬细胞、中性粒细胞和单核细胞比例下降。CellChat分析显示细胞间通讯网络改变，其中中性粒细胞与巨噬细胞通过Nampt-(Itga5+Itgb1)配受体对信号增强。伪时序分析发现Birc5+肿瘤细胞在轨迹终点富集，而Fos+细胞比例降低。GTF3C4高表达于中性粒细胞，其缺失群体中PI3K/AKT通路相关基因显著富集。
2.5 GTF3C4作为乳腺癌预后生物标志物
TCGA数据分析显示GTF3C4在乳腺癌组织中高表达，且与不良总生存期相关（HR=1.44, p=0.026）。其表达与免疫检查点基因（如PD-L1）正相关，Hallmark基因集富集分析提示其参与PI3K/AKT-mTOR通路调控。
2.6 蟾毒灵通过靶向GTF3C4抑制乳腺癌增殖
分子动力学模拟表明GTF3C4-蟾毒灵复合物在89 ns时形成3个氢键，系统平衡后RMSD为1.3 nm。CETSA和DARTS实验验证蟾毒灵可增强GTF3C4热稳定性并抑制酶解，SPR测定结合常数KD=21.10 μM。GTF3C4敲低后，细胞增殖受阻，EdU阳性率下降，凋亡率上升。
2.7 蟾毒灵通过GTF3C4调控PI3K/AKT通路
Western blot显示GTF3C4敲低或蟾毒灵处理均降低p-PI3K、p-AKT、Bcl-2、c-Myc蛋白水平，升高Bax、Cleaved-caspase 3表达。体内实验证实蟾毒灵下调GTF3C4并抑制PI3K/AKT通路活化，同时调节上皮-间质转化（EMT）相关蛋白（E-cadherin↑, N-cadherin↓）。
3 讨论
本研究首次揭示GTF3C4是蟾毒灵的直接作用靶点，其通过抑制PI3K/AKT通路及重塑肿瘤免疫微环境发挥抗乳腺癌作用。单细胞测序从细胞亚群层面解析了蟾毒灵对巨噬细胞极化、中性粒细胞通讯的调控，为联合免疫治疗提供新思路。局限性在于未开展细胞共培养实验验证细胞互作，未来需针对不同乳腺癌亚型深化研究。
4 结论
蟾毒灵通过靶向GTF3C4-PI3K/AKT轴，调控细胞周期、凋亡、EMT及免疫微环境，多维度抑制乳腺癌进展。该研究为天然药物抗肿瘤机制提供了多组学证据链，GTF3C4有望成为乳腺癌治疗新靶点。
5 实验方法
实验涵盖CCK-8、流式细胞术、LiP-MS、scRNA-seq（10×Genomics平台）、分子对接（AutoDock Vina）、SPR等关键技术。动物实验遵循北京中医药大学伦理委员会审批（BUCM-2023101003-4025），统计学分析采用GraphPad Prism 9.5.1。
