《Journal of Hazardous Materials》：A coupled fluorescence assay for high-throughput screening of polyurethane-degrading enzymes
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针对聚酯聚氨酯（PU）降解酶筛选效率低的问题，本研究开发了基于合成PEA-PU底物的高通量荧光检测方法，通过酶解释放的乙二醇经双酶系统转化为荧光信号，实现快速定量分析。验证显示该方法与HPLC结果高度一致，并成功筛选出高效酶变种，为工业级PU回收提供新策略
杨六军|邓贤军|刘仁菊|李建阳|蔡俊尧|马晓晓|游世阳|何庆豪|林亚瑟·K·L.|邵宗泽|卢宏远
香港科技大学（广州）生物科学与生物医学工程系，中国广州511400
摘要
全球塑料废物的累积，包括聚氨酯（PU），迫切需要解决方案。酶促降解为PU废物的再利用提供了一种可行的策略。然而，缺乏可靠的高通量筛选（HTS）方法来鉴定降解PU的酶，这阻碍了进展。传统方法要么由于底物相关性差，要么由于定量不准确，限制了其工业应用性和预测准确性。在这里，我们开发了一种HTS方法，该方法结合了化学定义的合成聚己二酸乙烯酯基PU（PEA-PU）底物和灵敏的荧光检测级联系统。在酶促水解过程中，PEA-PU释放出己二酸和乙二醇，后者通过两种酶系统（甘油脱氢酶和二色酶）转化为瑞索鲁芬。该检测方法能够快速、定量并高重复性地监测PU的降解过程。使用已知的PU降解酶（ICCM和BaCut1）进行验证，证明了荧光衍生的乙二醇水平与色谱测量结果之间存在强相关性，从而确认了其定量准确性。与商业底物不同，我们的方法建立了明确的结构-活性关系，并能够直接量化产物。为了展示该方法的实用性，我们筛选了一个BaCut1突变体库，并迅速鉴定出对合成底物和商业PU泡沫具有更强降解效果的突变体。最终，这项工作弥合了高通量能力和材料相关性之间的差距，为加速发现和工程化用于实际PU塑料再利用的酶提供了可扩展的途径。
引言
塑料污染是一个紧迫的全球性问题，威胁着生态系统[1]、[2]、[3]以及人类健康[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]。聚氨酯（PU）是导致这一危机的主要因素之一，它是一种广泛应用于泡沫（如床垫、绝缘材料）、弹性体（如鞋底、医疗设备）和耐用商品（如汽车零件、合成皮革）的合成聚合物[9]、[10]、[11]、[12]。鉴于PU废物的回收率较低[12]、[13]，其环境持久性凸显了迫切需要可持续的解决方案[13]、[14]、[15]、[16]。
酶促降解已成为PU废物再利用的一个有前景的策略，吸引了越来越多的研究兴趣[10]、[13]、[14]、[15]、[17]、[18]。然而，这一领域的进展仍然有限。这主要是由于在工业条件下高效降解PU的酶的识别、表征和工程化方面存在持续挑战[10]、[14]、[15]、[17]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]。
当前酶筛选方法（表1）存在预测准确性和实际应用性的限制。使用低分子量模型底物（如对硝基苯酯或氨基甲酸酯）的传统方法往往无法准确预测酶对真实聚合物PU的活性，导致误报，从而误导了酶的发现工作[14]、[15]、[17]、[19]。相比之下，虽然工业PU材料（如泡沫、薄膜、弹性体）具有更高的生理相关性，但其异质性和缓慢的降解动力学使其不适合高通量筛选（HTS）应用[12]、[15]、[20]、[21]。此外，尽管纳米传感器[24]和微流控[25]的最新创新提高了通量，但这些平台通常依赖于间接替代探针，无法准确反映真实固体PU的降解情况。
因此，许多研究转向使用胶体PU分散体（如Impranil DLN或Bayhydrol），通过观察添加酶或微生物后PU乳液中的透明区形成或OD值下降来检测酶活性[14]、[26]、[27]。然而，这些专有混合物在化学上没有明确定义，只能检测总体酯酶活性。这些限制阻碍了严格的定量分析，而定量分析对于酶的发现和机制研究至关重要[14]、[15]、[20]、[24]。
为了克服这些限制，我们开发了一种HTS方法，使用一种合成PU底物，在酶促水解过程中释放可检测的降解产物。通过将这一反应与能够将降解产物转化为光学信号的检测级联系统耦合，我们实现了实时动力学测量和直接的活性比较。
该方法通过提供定量、高通量的PU水解动力学测量，解决了现有方法中的关键问题，使得快速而精确的酶变体筛选成为可能。使用已知的PU降解酶进行严格验证，证实了其高敏感性、重复性和稳健性。为了展示其实际应用性，我们应用这一框架筛选了一个BaCut1饱和突变体库，成功鉴定出对聚己二酸乙烯酯（PEA-PU）和商业PU泡沫具有增强降解效果的突变体。
材料
除非另有说明，所有试剂均为分析级，并按原样使用。羟基封端的聚己二酸乙烯酯（PEA，Mn ≈ 1000 g/mol，CAS编号24938-37-2）、4,4′-亚甲基双（苯异氰酸酯）（MDI，CAS编号101-68-8）和无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF，CAS编号68-12-2）均购自Aladdin Industrial Corporation（中国上海）。聚酯PU泡沫来自Dagong foam Co., Ltd（中国南通）。
Resazurin（≥98%，CAS编号550-82-3）和二色酶来自
PEA-PU的合成与表征
为了开发一种用于检测PU降解酶的定量方法，我们设计了一种化学定义明确且易于合成的聚合物底物。该聚合物含有由PEA组成的柔软段。其酯键的水解产生两种明确的产品：乙二醇（EG）和己二酸（AA），这两种产物都可以高可靠性地被定量。具体而言，PEA-PU聚合物是通过一步溶剂法逐步聚合反应合成的[27]、[29]（图1A）。
结论
开发有效的PU降解酶HTS方法对于发现和优化生物催化剂以应对PU污染至关重要。在这里，我们提出了一种HTS方法，该方法结合了化学定义的PEA-PU底物和酶促级联系统，将按化学计量释放的EG转化为灵敏的荧光信号。我们的方法与传统分析技术（如HPLC）具有极好的一致性，显示出相当的可靠性
环境影响
聚氨酯（PU）污染威胁着全球生态系统，因为传统的处理方法（如填埋和焚烧）会造成持久性的危害。为了解决这个问题，我们开发了一种高通量荧光检测方法，使用化学定义的PU底物（PEA-PU）来定量评估酶促降解。这种标准化方法加速了从微生物群落中发现新的PU降解酶，并有助于改进生物催化剂的开发。
资金来源
本研究得到了中国国家自然科学基金（编号32471547）、广东省基础与应用基础研究基金（编号2025A1515010527）、南沙重点科技项目（编号2023ZD015）、广州市科技计划市校联合资助项目（编号2023A03J0001）以及广东省科技厅（编号2025A0505000039）和福建省科技计划项目（编号2025I0045）的支持。
CRediT作者贡献声明
卢宏远：撰写——审稿与编辑、监督、资源管理、方法论、研究设计、资金获取、概念构思。林亚瑟·K·L.：项目管理。邵宗泽：撰写——审稿与编辑、监督、资源管理。游世阳：数据可视化、验证。何庆豪：验证、项目管理、方法论。蔡俊尧：资源管理、数据分析、数据整理。马晓晓：数据可视化、数据整理。刘仁菊：撰写——审稿与编辑、验证利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
我们感谢香港科技大学（广州）（HKUST(GZ）的生物科学中央研究设施（BioCRF (GZ)）和材料表征与制备设施（MCPF (GZ)）的支持。他们在实验程序和材料表征方面的协助对这项研究至关重要。
