综述：啮齿动物少突胶质细胞前体细胞分离与培养技术的进步：从传统方法到现代技术

《Journal of Neuroscience Methods》：Advances in Rodent Oligodendrocyte Precursor Cells Isolation and Culture: From Traditional Methods to Modern Approaches

本文系统综述了啮齿类动物少突胶质前体细胞（OPCs）的分离与培养技术，比较了机械分离、免疫分选、MACS/FACS及血清-free等方法的优缺点，强调需结合实验条件优化细胞纯度、功能及稳定性，为神经再生研究提供标准化参考。

　　

霍达·阿克巴里（Hoda Akbari）| 伊拉吉·拉格迪-卡沙尼（Iraj Ragerdi-Kashani）| 法尔扎内赫·雷扎伊-亚兹迪（Farzaneh Rezaei Yazdi）| 帕里切赫尔·帕斯巴赫什（Parichehr Pasbakhsh）| 西娜·莫贾维罗斯塔米（Sina Mojaverrostami）

伊朗德黑兰医科大学医学院解剖学系

摘要

引言

少突胶质细胞前体细胞（OPCs）负责生成髓鞘形成型少突胶质细胞，对中枢神经系统（CNS）的髓鞘形成和修复至关重要。过去几十年中，人们提出了许多方法来可靠地分离和培养OPCs，以促进对少突胶质细胞生物学的研究，并开发有效的治疗策略，例如在脱髓鞘和神经退行性疾病中的细胞移植和药物治疗。然而，每种方法在纯度、产量和表型稳定性方面仍存在挑战。

方法

我们使用Scopus、Google Scholar、PubMed和PubMed/Medline数据库中的相关关键词进行了文献回顾，时间范围从开始日期到2025年11月1日。我们研究了符合搜索参数的啮齿动物模型中的临床前研究，包括体外和体内的大鼠或小鼠模型，以及新生儿和成体的中枢神经系统研究。

结果

本综述系统地描述了从机械分离方法到先进的免疫淘选培养系统、磁激活细胞分选（MACS）以及无血清或基于生长因子的培养系统在OPCs分离方面的方法进展。此外，还提到了重要的新方法，如3D培养模型或常氧培养模型，这些方法提高了细胞的纯度、功能和相关性。

讨论

本文比较了各种方法的原则、优点和缺点，以制定一套选择最佳方法的指南，以便根据实验设备和目标进行选择。同时，还提出了设计更加标准化、可扩展且符合伦理要求的OPCs分离系统的方法，这可能加速这些系统在再生神经科学中的应用。

引言

脊椎动物神经系统的快速高效功能依赖于髓鞘的独特组织结构（Saab和Nave，2017）。在中枢神经系统（CNS）中，当少突胶质细胞（OLs）这种特定类型的胶质细胞将其改良的质膜同心包裹在轴突上时，就会形成髓鞘（Hammel等人，2022）。这种独特的排列不仅支持轴突结构，维持稳态，还提供能量代谢物，从而提高了电信号传递的速度（Bando等人，2008；Lee等人，2012）。髓鞘形成是一个动态且持续的过程；这意味着OLs的数量会随着轴突的神经活动而增加，确保髓鞘形成过程以及髓鞘膜内的蛋白质和脂质代谢一直持续到成年（Marangon等人，2024；Saab和Nave，2017）。有趣的是，成人的大脑可塑性和与学习相关的行为也依赖于这一过程（Fletcher等人，2021；Snaidero等人，2014）。此外，各种病理状况，如创伤性和血管事件（例如中风、脊髓损伤）、遗传异常、神经退行性疾病（例如多发性硬化症、阿尔茨海默病）、感染和原因不明的情况都可能导致髓鞘丧失，即脱髓鞘（Goldman等人，2012；Popescu和Lucchinetti，2012）。脱髓鞘还可能通过直接损伤导致OLs死亡（Franklin和Ffrench-Constant，2008）。随后，在OLs死亡和轴突保护丧失后，会出现进一步的继发后果，包括轴突损伤和神经元功能障碍（Ben-Hur，2011）。

OLs分布于成年CNS的白色和灰色物质中（Bradl和Lassmann，2010）。少突胶质细胞前体细胞（OPCs）是OLs的起源（Kuhn等人，2019）。在成年期或病理损伤后，OLs会被OPCs取代（Young等人，2013）。脱髓鞘后，髓鞘修复和再生的机制被启动，促使OPCs从它们的微环境迁移到损伤部位。随后，通过OPCs的增殖及其在病变部位发育为髓鞘形成型OLs，实现再髓鞘形成（Franklin和Goldman，2015；Piaton等人，2009）。然而，据报道，内源性OPCs的再髓鞘形成量和质量有限，神经功能并未得到改善（Franklin，2002）。再髓鞘形成失败的原因尚不清楚；然而，年龄、炎症、疾病进展、细胞碎片以及细胞外环境中的抑制因素等因素可能会影响OPCs的招募及其迁移、增殖和分化能力（Kuhlmann等人，2008；Williams等人，2007）。由于OPCs会分化为髓鞘形成型OLs，因此将它们移植到动物和人类模型中可以作为一种替代丢失细胞并提供神经保护的治疗手段（Chen等人，2015；Piao等人，2015；Pourabdolhossein等人，2017）。此外，OPCs与其他细胞（包括小胶质细胞、星形胶质细胞、神经元）的相互作用，以及其在体内和体外对血脑屏障（BBB）的调节功能，受到了前所未有的关注（Yalcin和Monje，2021）。因此，获得分离和培养啮齿动物OPCs的最佳方法至关重要，这是临床前研究的基础，有助于理解这些细胞的生物学特性并开发新的治疗方法。已经开发了多种分离技术，每种技术都有其特定的优缺点。例如，传统的混合胶质细胞培养方法虽然耗时，但被认为是基本且广泛使用的方法，但这种方法的污染风险也较高（Sanchez-Gomez等人，2018；Zhu等人，2014）。其他替代技术包括磁激活细胞分选（MACS），该方法通过使用表面抗原A2B5和O4的免疫磁珠提高了细胞的存活率和纯度，但也需要专门的设备且成本较高（Janowska等人，2023）。或者寡球体方法，常用于转基因动物中，从皮质神经前体细胞产生均匀的小鼠OPCs（Chen等人，2007b）。无论采用何种分离技术，都提出了培养OPCs的方法，如使用无血清培养基或调节生理氧水平，以保持其增殖和分化为OLs的能力，并确保细胞在体外的长期存活（Janowska等人，2023；Zhu等人，2014）。然而，高生产成本、细胞增殖不准确、基因组不稳定和二次污染仍被认为是培养过程中最严重的问题（Lorsch等人，2014；Slanzi等人，2020）。

本综述研究的目的是检查和比较啮齿动物OPCs的分离方法（机械分离、免疫淘选、MACS/FACS）和培养方法（定义的培养基、细胞分化模型），以实现高纯度和数量的OPCs。此外，我们还介绍了每种方法的优点和缺点，以便研究人员确定方法的可重复性、该方法对OPCs分化的影响及其在疾病研究中的通用性。

材料与方法

在这篇叙述性综述文章中，我们基于相关的MeSH术语（少突胶质细胞前体细胞/少突胶质细胞、分离/分离技术/培养技术/方法/程序/协议、啮齿动物/大鼠/小鼠/鼠）采用了广泛的搜索策略来查阅文献，搜索范围涵盖了主要科学数据库中的标题和摘要字段，包括Scopus、Google Scholar、PubMed和PubMed/Medline，涵盖了所有可用的出版物。

OPCs

一种称为OPCs的特定类型的胶质细胞占中枢神经系统白色和灰色物质中细胞的约5-8%（Dawson等人，2003）。它们存在于运动皮层、胼胝体（Clarke等人，2012）、视神经（Shi等人，1998）、小脑（Levine等人，1993）和脊髓（Rowitch和Kriegstein，2010）中。这些双极细胞具有较高的增殖和迁移能力；然而，白色物质中的OPCs被认为尤为重要。

OPCs的分离方法

在病理性的脱髓鞘条件下，OPCs会迁移到损伤部位进行增殖和分化；然而，患者年龄、疾病进展、炎症和细胞碎片等各种因素可能会干扰这一过程，从而降低髓鞘形成的效率（Franklin，2002）。OPCs的分离和培养是研究髓鞘形成机制和组织再生的有效方法，有助于解释髓鞘形成失败的原因，并改善

基础机械方法：混合胶质细胞培养和摇匀技术

McCarthy和de Villiers引入了早期的OPCs分离方法，并建立了“混合胶质细胞+摇匀”方法，用于获得纯化的星形胶质细胞和少突胶质细胞谱系细胞。在此方法之前，由于培养物中的细胞杂质，区分星形胶质细胞和少突胶质细胞较为困难。这种方法依赖于胶质细胞的固有粘附特性，而不是酶促消化，从而能够在体外将两种谱系分开

免疫淘选分离

随着OPCs研究超越了纯机械方法的局限，免疫淘选成为首批能够产生高度纯化谱系特异性细胞群体的方法之一。该方法依赖于胶质细胞对抗体包被基底的选择性粘附，通过连续的负筛选和正筛选步骤将所需细胞类型与不需要的细胞类型分开。这种方法对于小鼠研究尤为重要，因为在小鼠中星形胶质细胞和OPCs的分层较弱

培养条件和环境调节因子（氧气、血清、密度、生长因子）

OPCs培养的一个主要挑战是这些细胞对微妙环境因素的敏感性——即使是微小的环境变化，如氧气张力、血清暴露、营养补充剂和细胞密度，都会影响其增殖、存活和谱系进展。这些参数的微小偏差可能会改变细胞的命运或导致细胞应激，这解释了为什么体外行为往往与体内OPCs的生理状态不同，因为体内的氧气水平仅在2-5%之间，而不是21%

先进培养平台：寡球体、3D培养和新型分离方法

随着机械策略的发展超越了最初的摇匀协议，研究人员寻求结合程序简单性和提高生化精确度及保留OPCs活力的混合分离方法。Medina-Rodríguez等人在2013年系统地比较了两种常用小鼠品系CD-1和C57BL/6从新生儿（P0，P15）到成年（P60，P180）阶段的OPCs分离情况

分离后的OPCs分化方法：关键步骤和因素

OPCs的分化通常是通过将细胞从增殖环境转移到有利于成熟的条件来实现的，这一过程通过减少或撤除促分裂因子（如PDGF-AA、FGF₂、EGF和IGF-I）来启动，这些因子广泛用于维持OPCs在体外的扩增（23, 24, 26, 50）。随后添加甲状腺激素，特别是T3和T4，可以促进前少突胶质细胞向未成熟和成熟少突胶质细胞的转化，通过增强表达

结论

我们的综述指出，没有一种单一的OPCs分离技术能够完全满足现代胶质研究的多样化需求；然而，现有的证据使我们能够概述未来标准方法的基本特征。一个可靠的方案必须平衡纯度、活力、可扩展性和在不同年龄段的啮齿动物及实验目标中的适用性。本文回顾的大多数研究都是在啮齿动物的大脑和新生儿期进行的，而新的方法

CRediT作者贡献声明

伊拉吉·拉格迪-卡沙尼（Iraj Ragerdi）：撰写——原始草稿，概念构思。霍达·阿克巴里（Hoda Akbari）：撰写——审阅与编辑，撰写——原始草稿，研究，概念构思。帕里切赫尔·帕斯巴赫什（Parichehr Pasbakhsh）：撰写——审阅与编辑，撰写——原始草稿。法尔扎内赫·雷扎伊-亚兹迪（Farzaneh Rezaei Yazdi）：撰写——审阅与编辑，撰写——原始草稿。西娜·莫贾维罗斯塔米（Sina Mojaverrostami）：撰写——审阅与编辑，撰写——原始草稿，验证，概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。