《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：Construction of bio-layer interferometry biosensors via cell-free synthesized proteins for fishing bioactive compounds from Chinese herbs
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本研究开发了一种整合细胞游离蛋白合成（CFPS）、生物层干涉ometry（BLI）和高性能液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UHPLC-QTOF/MS）的快速高效平台，用于筛选传统中药（TCM）活性成分。成功鉴定出三种低毒、高亲和力的CXCR4靶向活性成分：黄连素、葛根素和千金藤素A，并首次证实后两者为CXCR4功能配体。
王彦婷|王晓菲|夏宁琪|陈浩|张林峰|卢斌|吕迪亚|曹燕
中国上海海军医科大学药学院生化药学系，200433
摘要
生物层干涉法（BLI）的应用依赖于将高纯度的目标蛋白固定在传感器上。传统的蛋白质表达和纯化过程繁琐且耗时，这限制了BLI在中药（TCM）高通量筛选中的应用。本研究旨在开发一种基于BLI的快速高效平台，用于筛选中药中的生物活性成分。我们建立了一个集成平台，结合了无细胞蛋白质合成（CFPS）、BLI和超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UHPLC-QTOF/MS），以实现中药生物活性化合物的高效发现。使用CFPS系统体外合成了功能性C-X-C趋化因子受体4（CXCR4），并通过表面等离子共振（SPR）和Western blotting进行了验证。将CXCR4固定在NTA生物传感器上后，能够进行基于BLI的中药提取物高通量筛选，随后通过质谱对目标化合物进行回收和鉴定。成功鉴定出三种生物活性中药成分：黄连素、葛根素A和Senkyunolide A。在6.25至100 μM的浓度范围内，这些成分均表现出微弱的细胞毒性。此外，葛根素A和Senkyunolide A对CXCR4具有明显的亲和力，KD分别为69.86 μM和14.7 μM，并显著抑制了细胞迁移。这是首次将葛根素A和Senkyunolide A鉴定为CXCR4的功能性配体。所建立的CFPS-BLI-UHPLC-QTOF/MS平台能够高效发现低毒性、高亲和力的针对CXCR4的中药治疗剂。
部分内容摘录
1. 引言
生物层干涉法（BLI）是一种实时定量测量方法，通过光纤生物传感器技术检测生物分子结合和分离过程中的光学薄膜厚度变化[1]、[2]、[3]。BLI技术无需荧光标记即可直接检测[4]，这意味着在检测过程中无需对生物分子进行标记或修饰，从而避免了可能引入的干扰和误差。
2.1. 试剂
CFPS快速耦合转录/翻译系统（产品编号：L1170）和pCMVTNT载体由Promega Corporation（美国威斯康星州麦迪逊）提供。NTA芯片、10×磷酸盐缓冲液（PBS）、10×含聚山梨酯20的Hepes缓冲液（HBS-P+）、Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）以及胎牛血清（FBS）购自Cytiva Biotechnology Co., Ltd（美国马尔堡）。预制凝胶（Tris-Gly，4-15%，15孔）和预制凝胶电泳溶液也来自该公司。
3.1. CXCR4蛋白的合成与鉴定
为了提高基因表达效率（优化mRNA稳定性和翻译效率），在启动子下游插入了β-珠蛋白的5’UTR作为引导序列（图1A）。在编码序列下游策略性地添加了多聚腺苷化信号，以增强mRNA稳定性和翻译产量。在CXCR4的N端工程化添加了六组氨酸标签，利用组氨酸残基对过渡金属离子（如Ni2?）的亲和性。
4. 结论
集成多技术平台已成为中药生物活性成分筛选的研究热点[24]。在本研究中，我们建立了一个创新平台，结合了CFPS、BLI和UHPLC-QTOF/MS技术，用于高效筛选中药中的生物活性化合物。使用CFPS系统成功合成了CXCR4，并通过SPR分析和Western blotting严格验证了其结构完整性和生物功能性。
CRediT作者贡献声明
王晓菲：撰写 – 审稿与编辑、验证、方法学、实验设计。王彦婷：撰写 – 初稿撰写、验证、方法学、实验设计。陈浩：撰写 – 审稿与编辑、监督、方法学。夏宁琪：验证、监督、数据管理。曹燕：撰写 – 审稿与编辑、数据可视化、资源协调、项目管理、概念构思。卢斌：撰写 – 审稿与编辑、监督。张林峰：方法学、数据管理。吕迪亚：撰写 –
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：82174092和82473892）和上海市自然科学基金（项目编号：21ZR1483000和22ZR1476900）的资助。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益冲突或个人关系。
