星形胶质细胞共培养重塑SHH通路抑制在胶质母细胞瘤及肿瘤干细胞中的双重效应

《Scientific Reports》：SHH pathway inhibition and astrocyte co-culture induce distinct responses in glioblastoma and cancer stem cells

本研究针对胶质母细胞瘤(GBM)治疗难题，探讨了肿瘤微环境中星形胶质细胞如何改变GBM细胞（GBMCs）及CD133+癌症干细胞(CSCs)对SHH通路抑制剂环巴胺的反应。研究发现，星形胶质细胞共培养显著调控了细胞的凋亡(CASP8)、周期停滞(G2/M vs G0/G1)及SHH通路基因(GLII, GLI3, SUFU)表达，重塑了治疗效果。结果强调了靶向SHH通路时必须考虑肿瘤微环境相互作用的重要性。

在大脑这片精密而复杂的战场上，有一种被称为胶质母细胞瘤(Glioblastoma, GBM)的恶性肿瘤，它以极强的侵袭性和极差的预后令人闻之色变。目前的治疗方法捉襟见肘，其中一个重要的原因在于肿瘤内部高度的异质性。除了大量的肿瘤主体细胞，还存在一小撮狡猾的“种子”——癌症干细胞样细胞(Cancer Stem-like Cells, CSCs)。这群细胞生命力顽强，常常依赖于一些在胚胎发育时期活跃、成年后休眠的信号通路，例如刺猬因子(Sonic Hedgehog, SHH)通路。SHH通路在肿瘤中被重新激活，成为了维持CSCs特性、驱动肿瘤生长和耐药的关键推手。然而，靶向SHH通路的抑制剂在临床试验中的疗效却不尽如人意。科学家们逐渐意识到，这可能是因为我们忽略了肿瘤赖以生存的“土壤”——肿瘤微环境(Tumor Microenvironment)。在大脑中，星形胶质细胞是最主要的神经胶质细胞，它们构成了肿瘤细胞的邻居。以往的研究大多在单一的肿瘤细胞培养体系中展开，这与真实的、充满细胞间对话的体内环境相去甚远。那么，当我们将肿瘤细胞置于与其体内邻居——星形胶质细胞共存的条件下，它们对SHH通路抑制剂的反应会发生怎样的改变？肿瘤干细胞与普通的肿瘤主体细胞反应相同吗？为了解决这些问题，研究人员设计了精巧的实验，旨在揭示肿瘤微环境如何重塑靶向治疗的应答图谱。

本研究综合运用了多项关键技术。研究人员建立了GBM主体细胞(GBMCs)和CD133⁺GBM干细胞(CSCs)的单培养体系，以及它们分别与星形胶质细胞的共培养体系。通过对这些体系的平行比较，研究人员使用了实时荧光定量PCR(RT-qPCR)来分析基因表达变化，免疫荧光染色(Immunofluorescence staining)来定位特定蛋白，酶联免疫吸附测定(ELISA)来量化分泌因子，末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL assay)来检测细胞凋亡，以及细胞周期分析(Cell cycle analysis)来评估增殖状态的变化。

SHH通路活性受到细胞类型和培养环境的双重调控

研究人员首先探究了SHH通路抑制剂环巴胺(Cyclopamine)在不同条件下的效应。结果显示，环巴胺处理改变了SHH通路活性，但这种改变强烈依赖于细胞类型（是GBMCs还是CSCs）以及培养条件（是否为星形胶质细胞共培养）。这表明，抑制剂的效应并非一成不变，而是受到细胞内在特性与外在环境的共同塑造。更有趣的是，研究发现星形胶质细胞的共培养本身就能够调控关键的SHH通路下游转录因子GLI1、GLI3及其抑制因子SUFU的表达，并且这种调控机制与环巴胺的药理抑制作用是不同的。这说明肿瘤微环境可以通过独立于药物的全新方式来干预通路活性。

肿瘤干细胞的自分泌信号在共培养中被削弱

研究人员测量了SHH配体的分泌水平。在单一培养条件下，GBM CSCs展现出比GBMCs更高的SHH分泌能力，这可能构成了维持其干细胞特性的自分泌环路。然而，在与星形胶质细胞共培养的条件下，环巴胺处理有效地削弱了CSCs的这种高分泌现象。这表明，在模拟体内的微环境中，抑制剂或许能够更有效地阻断肿瘤干细胞赖以生存的自分泌刺激信号。

细胞周期停滞模式发生根本性转变

细胞周期的分析揭示了截然不同的应答模式。在GBMCs中，SHH通路抑制主要引发了G₂/M期的停滞。而在CSCs中，抑制导致了G₀/G₁期的停滞。最关键的变化来自于星形胶质细胞的共培养：它将原本停滞在G₀/G₁期的CSCs，推向了一种增殖活性更强的G₂/M期停滞模式。这意味着，肿瘤微环境不仅能改变细胞的死活，还可能改变了它们的休眠状态，促使干细胞倾向于进入一个更容易受到后续治疗攻击的周期阶段。

凋亡通路被特异性地激活

研究人员深入分析了细胞的死亡机制。凋亡相关基因的表达谱和TUNEL染色结果显示，SHH通路抑制和星形胶质细胞共培养共同作用，特异性地增强了CSCs中外源性凋亡通路（主要通过胱天蛋白酶8， Caspase 8, CASP8）的激活。这表明，在模拟体内的环境下，靶向SHH通路能够更有效地诱导肿瘤干细胞走向程序性死亡，这对于清除复发根源具有重要意义。

本研究发表在《Scientific Reports》，其结论深刻地揭示了肿瘤治疗的复杂性。研究发现，SHH通路抑制剂环巴胺和源自肿瘤微环境的星形胶质细胞信号，各自独立但又相互作用，共同塑造了胶质母细胞瘤及其干细胞群体的分子表型和行为应答。具体表现为：SHH通路活性受到细胞类型与培养环境的双重调控；星形胶质细胞共培养能以不同于抑制剂的方式调控通路基因；它能削弱肿瘤干细胞的自分泌SHH信号；它能根本性地改变肿瘤干细胞的周期停滞模式，使其从静止的G₀/G₁期转向增殖活跃的G₂/M期；最重要的是，它与抑制剂协同，特异性地增强了肿瘤干细胞中外源性凋亡通路的激活。这些结果有力地强调了肿瘤微环境在决定治疗效果中的核心地位。它不是一个被动的旁观者，而是治疗的积极参与者和重塑者。本研究清晰地表明，靶向SHH通路或其他癌症驱动信号的有效策略，必须在能够重现关键细胞间相互作用（特别是与星形胶质细胞的相互作用）的模型中开发和验证。脱离微环境的单一靶向治疗策略，很可能无法预测药物在真实肿瘤内的复杂效应，这也为以往临床试验的失利提供了一个可能的解释。这项工作不仅深化了我们对胶质母细胞瘤生物学行为的理解，更为未来开发更精准、更有效的联合治疗模式提供了重要的理论依据和新的思路。