冻干脂质体共包埋维生素D3与B12强化酸奶：理化特性、感官评价及体外消化研究

《JOURNAL OF FOOD SCIENCE》：Yogurt Fortification With Lyophilized Liposomes Coencapsulating Vitamins D3 and B12: Physicochemical Characterization, Sensory Evaluation and Static In Vitro Digestion

本文系统探讨了以果胶包被的冻干脂质体作为双维生素（VD3与VB12）递送载体，用于酸奶营养强化的可行性。研究通过超声制备脂质体，优化冻干工艺（蔗糖为冷冻保护剂），并系统评价了强化酸奶在贮藏期间的理化稳定性、流变特性、感官接受度及体外消化生物可及性。结果表明，该策略可显著提升维生素在胃肠道环境中的稳定性与生物利用度，为功能乳制品开发提供新思路。

　　

1 引言

脂质体作为一种脂质基递送系统，因其能够包封生物活性化合物（如维生素）并提高其稳定性、溶解度和生物利用度，在制药、食品和营养保健品行业受到广泛关注。本研究旨在开发一种富含维生素D₃（VD3）和维生素B₁₂（VB12）的功能性酸奶，通过将这两种微量营养素包封在使用食品级磷脂制备的脂质体分散体中实现，该分散体经过果胶包被并进行了冻干处理。研究选择了最佳蔗糖浓度作为冷冻保护剂，以尽量减少冻干对囊泡完整性的不利影响。对冻干囊泡进行了生物活性保留和理化性质表征。除仅含氢化饱和磷脂的配方外，大多数配方中两种维生素的保留率均较高，这些配方的包封效率有所降低。将这些囊泡加入酸奶后，对强化产品的生物活性含量、理化和流变特性以及感官可接受性进行了评估。囊泡的添加未对酸奶稳定性或消费者接受度产生负面影响。使用INFOGEST 2.0协议进行的体外消化显示，仅在含有基于Phospholipon 90G的脂质体的样品中，胃相后维生素D₃的生物可及性增加；然而，在肠相后，所有配方均显示出更高的生物可利用度。维生素B₁₂的生物可及性在整个消化过程中保持一致。总体而言，结果证明了一种在常见乳制品中共同包封和保护疏水性和亲水性维生素的可行方法，为开发支持日常营养补充的功能性食品提供了一种有前景的策略。

2 材料与方法

2.1 材料

脂质体生产使用两种纯化大豆卵磷脂：Phospholipon 90G（P90G, >94% w/w 磷脂酰胆碱[PC]，氢化）和Lipoid S45（PS45, >45% w/w PC，10%–18% 磷脂酰乙醇胺[PE]，非氢化），均由Lipoid GmbH（Ludwigshafen, Germany）提供。苹果果胶（酯化度：50%–75%）、VD3（胆钙化醇，>98%纯度，分析标准品）和VB12（钴胺素，≥98%纯度）购自Sigma-Aldrich（St. Louis, MO, USA）。

2.2 方法

2.2.1 共包埋VD3和VB12的脂质体的生产及果胶包被

脂质体通过超声法制备。磷脂分散液通过将P90G或Lipoid S45（5 mg/mL）分散在去离子水中获得，然后使用探头超声均质器（SFX550, Branson, St. Louis, MO, USA）以60%振幅处理25个循环（开5秒，关2秒）。对于共包埋，加入1 mL VD3储备液（2.5 mg/mL）以达到50 μg VD3/mL，加入4 mL VB12储备液（0.25 mg/mL）以达到最终浓度20 μg VB12/mL。

果胶包被采用Nguyen等人的方法并经过Ferreira等人修改。将果胶分散在5 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中，浓度分别为2.5和5.0 mg/mL（R1和R2），室温下搅拌8小时。等体积（20 mL）的果胶和脂质体分散液在磁力搅拌下混合，使用蠕动泵（Master Flex 7528-30, Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA）以1 mL/min的速度加入果胶。仅对基于LS45的脂质体进行包被，因为Ferreira等人表明基于P90G的脂质体在添加果胶后不稳定。尽管如此，P90G配方仍保留了高生物活性含量，因此被纳入食品基质掺入和体外消化的比较中。

2.2.2 脂质体的冻干

脂质体分散液在液氮（-210°C，2分钟）中冷冻，并在工作台冻干机（L101-Liotop, S?o Carlos, Brazil）中于-53°C、444 μHg真空下冻干72小时。添加蔗糖作为冷冻保护剂，磷脂与蔗糖的质量比分别为1:2、1:3和1:4（w/w）。干燥样品在含有硅胶的干燥器中于25°C下储存长达4周。

2.2.3 冻干脂质体的重构

将冻干粉末在去离子水（pH 6.8 ± 0.1；可忽略的离子强度）中重构至其原始质量浓度，使用带三叶船用螺旋桨的机械搅拌器在100 rpm和室温下进行。在10、20和30分钟时取样以评估流体动力学直径和尺寸分布，确定复水效率和最佳重构时间。完全复水后，分析颗粒大小、分布和Zeta电位。

2.2.4 共包埋VD3和VB12的冻干脂质体的表征

2.2.4.1 水分含量、水分活度和吸湿性

使用红外水分分析仪（MB35, Ohaus, USA）在105°C下测定0.5 g样品的水分含量。使用露点水分活度仪（AquaLab 3TE, Decagon Devices, USA）在25°C下测量水分活度（A_w）。吸湿性按照Cai和Corke的方法进行评估。将0.2 g样品在干燥器（相对湿度=81.1%）中储存1周。结果以吸附水克数/100克干物质表示。平衡水分含量（H_eq）通过重量法测定。

2.2.4.2 仪器色度法

使用非接触式色度计（AEROS, HunterLab, VA, USA）在CIELab颜色空间中测量冻干脂质体的颜色，遵循国际照明委员会（CIE）指南，使用D65光源和10°观察角。测量的参数包括明度（L）和色度坐标（a, b）。使用公式计算彩度（C_ab）和色调角（h_ab）。储存第1天和第120天之间的总色差（ΔE）使用初始L₀、a₀和b₀*值通过公式计算。

2.2.4.3 VD3和VB12的定量

2.2.4.3.1 甲醇提取物制备

为定量包封的维生素，将0.3 g冻干样品与5 mL甲醇混合，涡旋5分钟（Multi Reax Heidolph, Germany），超声处理10分钟（Model 410US, Marte, Brazil）。样品在4°C下以7000 × g离心5分钟（5430R, Eppendorf, Germany）。收集上清液，并重复提取以最大化回收率。合并的提取物过滤（0.45 μm尼龙膜，13 mm内径）至2 mL琥珀色小瓶中进行高效液相色谱（HPLC）分析。

2.2.4.3.2 通过HPLC定量VD3

VD3的定量采用Staffas等人的方法并进行调整。使用岛津Prominence HPLC系统（Kyoto, Japan）和LC Solution软件（v1.25），配备四元泵、脱气机、自动进样器、柱温箱和二极管阵列检测器。在35°C下，在Shim-Pack VP-ODS柱（250 × 4.6 mm, 4.6 μm）上进行分离。流动相（甲醇:乙腈, 9:1 v/v）以0.60 mL/min流速运行。进样30 μL，在265 nm处检测。运行时间为10分钟。VD3的鉴定基于保留时间（7.30分钟），定量使用七个标准品（4.5–36 μg/mL）的外部校准曲线进行，每个标准品进样三次。

2.2.4.3.3 通过HPLC定量VB12

VB12的定量使用Bochicchio等人的修改方法，使用相同的岛津Prominence HPLC系统和LC Solution软件（v1.25）控制。在35°C下，在Kinetex EVO C18柱（150 × 4.6 mm, 5.0 μm; Phenomenex, USA）上进行分离。流动相为水:乙腈（87.5:12.5 v/v），含0.02%甲酸，流速为0.60 mL/min。每个样品进样10 μL，在362 nm处检测，运行时间10分钟。鉴定基于与VB12标准品比较的保留时间（5.14分钟）。定量使用六个标准溶液（4.3–21.2 μg/mL）的峰面积进行外部校准，每个标准品进样两次。

2.2.4.4 扫描电子显微镜（SEM）

使用HITACHI TM-300台式SEM（Tokyo, Japan）评估冻干脂质体的形态。样品安装在带有碳导电胶带的铝桩上，无需喷涂。在15 kV和200倍放大倍数下拍摄图像。

2.2.5 含维生素负载冻干脂质体的酸奶生产

通过将2%（w/w）的脂质体粉末添加到商业全脂酸奶（Nestlé S.A.）中，然后手动搅拌（约5分钟）直至均匀，来生产富含VD3和VB12负载冻干脂质体的酸奶。选择发酵后添加以保持脂质体完整性和维生素稳定性，并反映发酵乳制品可行的工业化强化策略。评估了五种配方：（i）空白（未强化酸奶）；（ii）Y90G（含有P90G脂质体）；（iii）YS45（含有LS45脂质体）；（iv）YR1（含有LS45-R1果胶包被脂质体）；（v）YR2（含有LS45-R2果胶包被脂质体）。每种配方，包括未强化的对照（空白），均制备三个重复，转移到相同的玻璃容器中，密封，并在10°C下储存直至进一步分析。

2.2.6 含维生素负载冻干脂质体的酸奶的表征

2.2.6.1 理化表征

使用pH计（Digimed, Brazil）测量酸奶的pH值。水分活度测定同第2.2.4.1节。可滴定酸度通过用0.1 N NaOH滴定10克稀释在10 mL去离子水中的酸奶至pH 8.2来测定（AOAC, 1990）。结果使用公式计算，以克乳酸/100克酸奶表示。

2.2.6.2 脱水收缩率（%S）

通过将30克酸奶放在漏斗中的滤纸上，下方放置锥形瓶，在8°C冰箱中静置5小时来测定脱水收缩率。称量析出的乳清重量，脱水收缩率（%）按公式计算。

2.2.6.3 仪器色度法

在储存期间，使用仪器色度法评估由VB12引起的颜色变化。将样品放入培养皿中，并在与冻干脂质体相同的条件下测量颜色参数（第2.2.4.2节）。

2.2.6.4 近似成分

近似成分包括蛋白质（AOAC, 1990）、脂质（Bligh and Dyer, 1959）、水分和灰分含量（Instituto Adolfo Lutz [IAL], 2008）。碳水化合物通过从总质量中差值计算。

2.2.6.5 流变学表征

流变行为按照Sah等人（2016）的方法进行评估，使用旋转流变仪（AR2000, TA Instruments, USA）和锥板几何（2°, 60 mm）。测量在10°C下进行，随后平衡2分钟。在稳态条件下施加剪切速率（0.01–100 s^?1），并将流动曲线拟合到Herschel–Bulkley模型。

振荡测试评估粘弹性。首先在10°C（应变：0.01%至15%，1 Hz）下确定线性粘弹性区域（LVR）。然后测量储能模量（G′）和损耗模量（G″）。在0.1%应变下进行频率扫描（0.1–10 Hz）以表征频率依赖性粘弹性行为。

2.2.6.6 酸奶中VD3和VB12的测定

为定量VD3和VB12，将8克酸奶与9 mL甲醇使用高速匀浆器（T25, IKA, Germany）在9000 rpm下匀浆1分钟，随后涡旋10分钟和超声处理10分钟。离心（7100 × g, 5分钟, 4°C）后，收集上清液。残渣使用相同程序重新提取，合并上清液，涡旋，超声处理，并用50 μL甲酸进行蛋白质沉淀。最终离心后，提取物过滤（0.45 μm）并转移至色谱小瓶。维生素定量通过HPLC进行，如第2.2.4.3.2和2.2.4.3.3节所述。

2.2.6.7 微生物学表征

微生物学分析包括乳酸菌、酵母菌、霉菌、大肠菌群和大肠杆菌的计数，使用APHA方法（Reasoner, 2004）。每个样品制备五个系列稀释度，稀释液为0.1%蛋白胨水。乳酸菌采用倾注法接种（10^?4–10^?6）于MRS琼脂，在37 ± 1°C培养48 ± 3小时。结果以CFU/g表示。酵母和霉菌接种（10^?1–10^?3）于DRBC琼脂，在25 ± 1°C培养5天。使用Compact Dry EC平板评估大肠菌群和大肠杆菌。

2.2.6.8 静态体外消化、维生素释放和蛋白质水解

体外消化遵循标准化的INFOGEST 2.0协议（Brodkorb et al., 2019），并预先验证了酶活性和胆汁盐浓度。消化过程分为三个阶段：

1. 1.
   口腔相（OP）：5克酸奶与4.975 mL模拟唾液流体（SSF）和25 μL CaCl₂·2H₂O（0.3 M）混合，在37°C搅拌2分钟。
2. 2.
   胃相（GP）：向口腔食团中加入8 mL模拟胃液（SGF）、0.5 mL胃蛋白酶（2000 U/mL）、5 μL CaCl₂·2H₂O（0.3 M）和去离子水（至总体积20 mL）。将pH调节至3.0，混合物在37°C、200 rpm下孵育2小时。
3. 3.
   肠相（IP）：向胃食糜中加入8.5 mL模拟肠液（SIF）、5 mL胰酶（胰蛋白酶活性：100 U/mL）、2.5 mL胆汁提取物（10 μM）、40 μL CaCl₂·2H₂O（0.3 M）和去离子水（至总体积40 mL）。将pH调节至7.0，在37°C、200 rpm下继续孵育3小时。
   消化后，样品在液氮中快速冷冻。通过HPLC（第2.2.4.3.2和2.2.4.3.3节）分析VD3和VB12浓度。使用OPA方法（Nielsen et al., 2001）定量蛋白质水解，使用酶标仪（Benchmark Plus; Bio-Rad, Hercules, USA）在240 nm处测量吸光度。

2.2.6.9 感官评价

感官评价方案经FZEA/USP研究伦理委员会批准（CAAE: 69942223.9.0000.5422）。共有123名未经训练的消费者签署知情同意书后参与了酸奶评价。使用了两种方法：情感测试和勾选所有适用项（CATA）法。在情感测试中，参与者在外观、颜色、质地、风味、香气和总体可接受性方面进行9点喜好评分（1=极其不喜欢 至 9=极其喜欢），并表明购买意向。在CATA法中，参与者从预定义的描述酸奶属性的术语列表中选择术语：甜、柔软、流体、粘稠、结块、均匀、不均匀、粘性、水样、酸味、后味、奶油状、液体、稠厚、粉红色。CATA数据以选择每个样品每个属性的消费者百分比表示。使用Cochran's Q检验（p < 0.05）分析频率，以确定每个描述符在样品间的总体差异。当检测到显著差异时，使用McNemar检验（p < 0.05）进行两两比较，以识别哪些样品彼此不同。所有样品在评价前均经过微生物学测试（总大肠菌群、大肠杆菌、酵母菌和霉菌）以确保安全。

2.2.7 统计分析

所有测量均进行三次重复，结果以平均值±标准误报告。使用SAS软件v 9.2（SAS Institute Inc., NC）进行ANOVA分析，随后进行Tukey检验，显著性水平为5%。

3 结果与讨论

3.1 冷冻保护剂添加对脂质体冻干的影响

本节评估了由不同磷脂制备的脂质体在冻干和复水后的理化稳定性，重点关注其在酸奶强化中的适用性。复水后的稳定性对于确保在食品基质中的适当分散、均匀性和功能完整性至关重要。

表2总结了冻干复水后脂质体分散液的理化参数。无冷冻保护剂时，冻干的P90G脂质体显示出显著的尺寸增加（>2000 nm）和高PDI（>0.5），表明冻干过程中双层结构破坏导致聚集和异质性（Susa et al., 2021）。添加蔗糖（2:1 w/w）减少了颗粒尺寸并稳定了PDI（～0.3），表明有效的保护作用。更高的蔗糖浓度没有产生进一步的改善。复水时间（10–30分钟）没有显著影响，表明在不同时间点下复溶行为快速且一致。尺寸减小可能是由于蔗糖形成玻璃化基质，防止囊泡融合并稳定双层结构（Deng et al., 2023）。复水后所有样品的Zeta电位均下降，可能是由于冻干后或蔗糖吸附导致的表面电荷变化（Elhissi et al., 2010）。

未包被的LS45脂质体在没有冷冻保护剂的情况下也不稳定，需要至少30分钟的复水才能形成分散体，但尺寸仍然很大（989 nm）且异质（PDI = 0.51）。添加蔗糖（2:1 w/w）改善了稳定性并减小了尺寸；然而，更高的浓度（3:1和4:1 w/w）增加了PDI和尺寸，表明过量的蔗糖可能阻碍复水。与P90G一样，当存在蔗糖时，复水时间影响最小。LS45配方的Zeta电位比P90G更负，可能是由于更高的磷脂不饱和度增加了带负电荷的磷酸基团的表面暴露（Chun et al., 2013）。

果胶包被的脂质体在冻干和复水后显示出明显的尺寸增加，无论蔗糖浓度如何。最高的蔗糖水平（4:1 w/w）未能防止尺寸增大，表明果胶可能由于空间位阻或冷冻过程中的相互作用而干扰冷冻保护效果（Ma et al., 2025）。冻干前PDI > 0.3，冻干后> 0.5，反映了显著的尺寸异质性。无论冷冻保护剂或包被如何，复水后Zeta电位持续下降。包被水平（R1 vs. R2）或复水持续时间之间未观察到显著差异（p < 0.05），表明一旦存在冷冻保护剂，果胶浓度对稳定性的影响最小。

因此，确定蔗糖比例为2:1 w/w和复水30分钟为最佳条件，维持或改善了包被和未包被脂质体的理化稳定性。尺寸分布数据（图1）证实了LS45的单峰窄峰，以及P90G的较宽但仍可接受的分布。果胶包被的脂质体显示出多峰分布，峰值在4–6 μm范围内，但这些尺寸仍低于口腔检测阈值，不太可能影响酸奶质地或口感（Santagiuliana et al., 2019）。

3.2 共包埋VD3和VB12的冻干脂质体的生产与表征

3.2.1 视觉外观和形态

图2A显示了共负载VD3和VB12的冻干脂质体，由于VB12的存在，所有样品均呈粉红色。P90G配方比LS45配方的粉红色更浅、更鲜艳。两种未包被的类型均呈现结晶状，可能是由于用作冷冻保护剂的蔗糖所致。相比之下，果胶包被的样品颜色更浅，呈棉絮状质地，可能是因为果胶基质抑制了晶体形成，未观察到可见的蔗糖晶体。扫描电子显微镜（SEM）图像（图2B）显示，P90G和LS45产生无定形的片状颗粒，而LS45-R1和LS45-R2形成尖锐、相互连接的颗粒簇。这种结构与果胶中电离的羧基在干燥过程中发生交联，形成致密的纤维基质的研究结果一致（Chen et al., 2022）。LS45-R2中较高的果胶含量导致更无定形的结构和更少的结晶区域，这与冻干果胶/糖丰富粉末所报告的行为一致（Concei??o et al., 2016; Stachowiak et al., 2021）。

3.2.2 色度稳定性

色度分析证实了配方间的差异。参数C_ab、h_ab和ΔE（由表S1中的a和b计算得出）跟踪了储存期间的颜色变化。彩度（C_ab，图2C）表示颜色鲜艳度，在未包被样品中增加，尤其是在LS45中（第120天时从46.76增至50.66），表明红橙色色素转化。P90G也略有增加（43.13–46.63），但仍低于LS45。包被样品的C_ab值稳定得多：LS45-R1在第90天达到峰值25.36，而LS45-R2几乎保持不变（21.54–21.93），表明果胶限制了VB12暴露于降解因素。色调角（h_ab，图2D）表示颜色色调，P90G保持较低（7.16–10.11），反映了稳定的红色调。LS45从18.12变为30.80，向橙黄色移动，与C_ab增加和色素转化一致。包被样品保持稳定：LS45-R1约22°，LS45-R2接近31.5°，显示了包被对防止色调变化的保护作用。总色差（ΔE，图2E）量化视觉变化。值高于3即可察觉（Fontes et al., 2014）。LS45变化最大（ΔE从0到11.48），表明显著降解。P90G在第30天达到ΔE ≈ 5–6。包被样品的ΔE值较低：LS45-R1从0.95升至2.54，直到结束时仍低于可见性阈值。LS45-R2保持在1以下，表示不可察觉的变化。总之，结果表明果胶包被显著减少了颜色变化，并有助于在储存期间保持视觉完整性。

3.2.3 水分活度、水分含量和吸湿性

表3显示了A_w和水分含量的结果。与P90G（0.28 ± 0.04）和LS45（0.26 ± 0.04）相比，LS45-R1和LS45-R2的A_w值显著较低（0.14 ± 0.02），表明果胶包被增强了屏障性能。所有样品均低于0.6的A_w阈值，表明水在基质内结合（Damodaran, 2017）。水分含量从3.30%到4.74%不等，无显著差异（p > 0.05），LS45-R1和R2中略高的值并未提高A_w，强化了A_w和水分含量不直接相关的观点。然而，果胶包被样品的吸湿性显著更高（44.6和41.3 g H₂O/100 g干物质），这可能是由于亲水含量增加。这是多糖丰富粉末的典型特征，应储存在低A_w条件下以限制水分吸收。

3.2.4 储存期间维生素的保留

在120天内评估了VD3和VB12在冻干脂质体中的稳定性（图3；表3）。VD3的保留因配方而异。P90G显示快速降解，到第120天仅保留2%。相比之下，基于LS45的配方，无论是未包被还是果胶包被，均保持了100%的VD3，尽管初始浓度略低，可能是由于包被和干燥过程中的稀释。VB12遵循类似趋势：P90G仅保持28%，而未包被的LS45保持81%，损失主要发生在储存早期。果胶包被配方保留了100%的VB12，突出了果胶基质的强大保护作用。这种改善的保留可能归因于高酯化果胶的成膜和屏障特性，限制了维生素暴露于降解因素（Lopes et al., 2017; Hamadou et al., 2022; Su et al., 2024）。尽管存在初始稀释，果胶包被显著增强了维生素的长期稳定性。

3.3 含共包埋VD3和VB12的冻干脂质体的酸奶表征