《JOURNAL OF FOOD SCIENCE》：Multifunctional OEO-ZIF-8-HA Nanoparticles for Antibacterial Control on Latex Surfaces and Baby Arugula (Eruca Sativa) Leaves
1 引言
食源性疾病仍是全球公共卫生和经济关注的重点，其中单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）是食品工业中最持久和威胁生命的病原体之一。李斯特菌病与高住院率和死亡率相关，尤其在易感人群中。近年来，单核细胞增生李斯特菌污染新鲜农产品已导致多次疫情和召回事件，例如2015-2016年与包装沙拉蔬菜相关的多州李斯特菌病疫情，以及2021年俄亥俄州农场因检测到该菌而召回芝麻菜等温室种植的绿叶蔬菜。这些事件突显了即食绿叶蔬菜对单核细胞增生李斯特菌污染的脆弱性，并支持使用芝麻菜作为新型抗菌策略的测试基质。
单核细胞增生李斯特菌耐受冷藏、高盐度和弱酸性环境，使其难以从食品加工设施中根除。该菌株如ATCC 19115、ATCC 35152和ATCC 7644是食品安全研究中常用的标准菌株，具有可重复的生物膜形成能力和明确的毒力特征。其持久性归因于在多种食品接触材料（如不锈钢、聚氨酯、聚乙烯和乳胶）上形成稳健的生物膜。这些生物膜作为再污染库，释放浮游细胞并抵抗标准卫生处理。乳胶组件（如手套和密封件）由于疏水性和微观拓扑结构特别容易微生物附着。
生物膜通过细胞外聚合物基质和改变的代谢表现出对消毒剂的强抵抗力。传统消毒剂（如氯、季铵盐和过氧乙酸）通常对成熟生物膜失效，并可能腐蚀设备或形成有毒残留物。因此，创新的、无毒的抗菌策略正在探索中。纳米技术通过将多种抗菌机制结合到单一纳米结构中，为生物膜控制提供了有效平台。负载精油的纳米颗粒，特别是含有OEO的颗粒，因含有有效的酚类化合物香芹酚和百里香酚而具有前景，这些成分破坏细菌膜并诱导细胞内内容物泄漏。OEO已显示出强大的抗生物膜功效，但其挥发性和疏水性限制了稳定性和持久性。将精油封装在纳米颗粒中可改善分散性、保护挥发性活性物质并允许控制释放。
金属-有机框架（MOFs），特别是ZIF-8，因其高表面积、可调孔隙率和pH响应降解而成为理想的精油载体。ZIF-8释放具有内在抗菌活性的Zn2+离子。用金属如Ag或Fe掺杂ZIF-8可通过协同离子释放和活性氧（ROS）生成增强其抗菌效力。这些复合材料穿透生物膜，破坏细胞完整性，并优于传统消毒剂。此外，掺杂的ZIF-8框架可共同递送天然抗菌剂以增强持续效果。为提高分散性和生物相容性，纳米颗粒可用HA包被，HA是一种天然衍生的、无毒的多糖，以其亲水性、稳定性和抗粘附特性而闻名。尽管HA单独不具有杀菌性，但将其与金属掺杂的ZIF-8和OEO结合可创建整合抗粘附和抗菌机制的多功能系统。
芝麻菜（Eruca sativa）像其他绿叶蔬菜一样，由于其富含水分的微观结构极易微生物腐败。其叶片具有不均匀的表面，带有褶皱和小口袋，细菌可以隐藏其中，使得李斯特菌易于附着甚至形成保护层，这就是为什么仅冲洗通常不足以清除它。本研究选择金属掺杂的ZIF-8框架（Fe和Ag）是因为它们能够增强离子释放和生成ROS，从而放大对耐药病原体的抗菌效力。虽然精油已被封装在各种纳米颗粒系统中用于抗菌应用，但本研究通过独特的配方和应用推进了该领域。与先前方法相比，我们将OEO纳入掺杂Ag/Fe并用HA包被的ZIF-8 MOF支架中，产生了一种单一的纳米复合材料，提供受控的OEO释放、同时的抗菌离子递送（来自ZIF-8的Zn2+和来自Ag-ZIF-8的Ag+/Fe2+）以及HA层的抗粘附表面特性。这种功能组合先前未被报道，代表了增强基于精油的抗菌剂功效和稳定性的新策略。此外，通过将这些OEO-ZIF-8-HA纳米复合材料应用于食品接触表面（乳胶）和实际农产品（芝麻菜叶片），我们的研究展示了一种实用的、无氯的干预措施，用于控制单核细胞增生李斯特菌，连接了实验室效能与现实条件。
因此，本研究旨在开发和评估由OEO、HA和金属掺杂ZIF-8（Ag和Fe）组成的多功能纳米颗粒，用于控制乳胶食品接触表面和芝麻菜（Eruca sativa）叶片上的单核细胞增生李斯特菌，具体目标包括：（i）合成和表征OEO-Ag-ZIF-8-HA、OEO-Fe-ZIF-8-HA和OEO-HA纳米颗粒；（ii）通过几种微生物和生物膜抑制试验评估纳米颗粒对单核细胞增生李斯特菌的抗菌效能；（iii）评估在绿叶蔬菜加工中的应用及其对微生物减少和质量保存的影响；（iv）比较纳米颗粒与传统氯处理的性能。
2 材料与方法
2.1 纳米颗粒合成
抗菌纳米复合材料系统的合成涉及顺序、多步骤的制备过程，包括金属掺杂ZIF-8纳米颗粒的制备、HA表面功能化、精油负载和HA基纳米封装。Ag-ZIF-8按照Nguyen等人（2025）的方法合成，略有修改，通过将硝酸锌六水合物（1.96 mmol）、硝酸银（0.84 mmol）和2-甲基咪唑（64.4 mmol）在乙醇（1.4 × 103mmol）中结合在锥形瓶中，然后在21°C恒定搅拌下快速将配体溶液加入金属前体混合物中24小时以促进金属-配体配位和晶体生长。所得沉淀通过离心（8000 rpm, 10 min）分离，用乙醇洗涤三次以去除未反应组分，并在储存于干燥器之前真空干燥。Fe-ZIF-8以相同方式生产，用硫酸铁七水合物替代硝酸银。为生成HA功能化的金属掺杂纳米颗粒（Ag-ZIF-8-HA和Fe-ZIF-8-HA），将干燥的ZIF-8粉末分散到0.05 mg/mL HA（MW = 1500 kDa）水溶液中，以1:2质量体积比，涡旋2分钟确保完全润湿，搅拌30分钟允许HA静电吸附到带正电的ZIF-8表面，超声1分钟确保均匀包被，并离心（8000 rpm, 10 min）去除过量HA。沉淀用去离子水洗涤三次，真空干燥4小时获得稳定的HA包被粉末。精油负载变体（OEO-Ag-ZIF-8-HA和OEO-Fe-ZIF-8-HA）通过将0.5 g HA包被纳米颗粒分散到10 mL乙醇中合成，随后逐滴加入OEO（100滴）以促进疏水-亲水相互作用和扩散驱动的负载到ZIF-8多孔框架中。混合物搅拌30分钟，超声1分钟增强OEO渗透到分级孔和HA外层，离心（8000 rpm, 10 min），用去离子水洗涤三次去除未结合OEO，并在储存于21°C干燥器之前真空干燥4小时。使用Fe-ZIF-8-HA的平行合成以相同处理参数产生OEO-Fe-ZIF-8-HA。
独立地，生产了仅HA封装的精油系统（OEO-HA），通过将HA溶解在去离子水（1:3 mg/mL）中6小时，制备OEO-乙醇相（1:3 mL/mL）与Tween 80乳化以改善混溶性，并在超声5分钟下将油相引入HA溶液中以促进液滴尺寸减小和封装。悬浮液额外搅拌6小时以稳定HA-OEO相互作用，然后在35°C真空干燥以温和去除溶剂同时防止生物活性油成分挥发。浓缩样品随后在-80°C冷冻干燥72小时获得干燥、自由流动的OEO-HA粉末，适用于下游表征和抗菌测试。
2.2 纳米颗粒表征
简要地，纳米颗粒通过形态（扫描电子显微镜SEM、透射电子显微镜TEM）、元素分布（能谱仪映射EDS mapping）、官能团傅里叶变换红外光谱（FTIR）、结晶度X射线衍射（XRD）、表面电荷（zeta电位ZP）和颗粒尺寸（PS）（动态光散射DLS）进行表征。SEM和TEM成像确认纳米级尺寸和表面均匀性，XRD验证结构完整性和OEO及金属掺杂剂的成功掺入，而ZP和DLS分析评估胶体稳定性和分散行为。
形态分析使用SEM（Quanta 600 FEG SEM）在溅射涂覆薄铂层后进行，SEM成像在20 kV下以2000×–4000×放大倍数提供详细表面形态，而EDS与SEM联用实现元素映射，生成关键元素的颜色编码分布并确认纳米颗粒表面均匀元素掺入。TEM进一步用于解析纳米级结构特征。纳米颗粒分散在乙醇中，超声，滴铸到碳包被铜网上，并使用JEOL 1200 EX显微镜在200 kV下成像。对于每种配方，检查至少十个视野，放大倍数从50,000×到200,000×，以确保PS、形状和分散的代表性分析，可选应用醋酸铀酰染色以增强对比度。
化学完整性和官能团组成通过FTIR光谱（IR Prestige-21 Spectrometer）在衰减全反射模式下在400–4000 cm?1光谱范围内验证，测量进行三次以确保重现性。晶体结构通过XRD使用Bruker D8 Endeavor衍射仪与Cu Kα辐射评估，遵循标准化协议以识别特征衍射峰并确认HA包被和OEO负载后保留结晶ZIF-8框架。
表面电荷和胶体稳定性通过ZP测量使用Malvern Zetasizer Nano ZS评估，纳米颗粒分散在乙醇（2 mg/mL）中，超声，并在25°C下三次分析。PS分布通过动态光散射在类似分散条件下测量，提供水动力直径和聚集行为的洞察。最后，热稳定性和相变使用差示扫描量热法（DSC）检查，其中密封纳米颗粒样品在氮气氛下从20加热到400°C。DSC热分析图允许识别与熔化、分解或结构转变相关的吸热和放热事件。
2.3 细胞毒性试验
细胞毒性使用Cell Counting Kit-8（CCK-8）试验评估。纳米颗粒悬浮液与哺乳动物细胞孵育48小时，细胞活力通过450 nm吸光度测量。测试浓度高达2000 μg/mL以确定剂量依赖性效应。
2.4 抗菌测试
针对几种单核细胞增生李斯特菌菌株（ATCC 19115、35152、7644）混合物的抗菌效能通过纸片扩散、最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）试验评估。每种菌株的冷冻储备（–80°C）从德克萨斯A&M大学微生物实验室培养物收集获得。为制备多菌株鸡尾酒，每种菌株的过夜培养物调整到约108CFU/mL。每种悬浮液的等体积（1 mL）在无菌TSB中组合，涡旋2分钟确保均质性，并立即用于下游试验以模拟多菌株污染场景。
对于纸片扩散试验，合成的纳米颗粒粉末分散在去离子水中浓度为1500 μg/mL，每种悬浮液0.2 mL加载到无菌滤纸片（0.5 cm直径）上并放置在接种的TSA平板上（在0.5 cm深度），在37°C孵育24小时，之后抑制区直径以毫米测量。表现出最大抑制区的纳米颗粒比例被选择用于进一步抗菌优化。MIC和MBC值通过肉汤微量稀释在96孔板中确定，OD630读数在24小时孵育期间每小时采集。MBC定义为在TSA平板上产生≥3-log CFU减少的最低浓度。所有实验进行三次以确保重现性，未处理接种物和仅培养基孔分别作为阳性和阴性对照。
2.5 乳胶表面生物膜抑制
2.5.1 表面制备
乳胶试片（1 cm × 1 cm × 0.008 cm）最初使用Liquinox清洁，彻底用蒸馏水冲洗，并在60°C干燥。 after washing and water rinsing, they were treated with a 500-ppm chlorine solution for 30 min, dried overnight in a biosafety cabinet, and sterilized by UV irradiation on both surfaces for 30 min. The prepared coupons were then stored aseptically in sterile tubes at room temperature (21°C) for further use.
2.5.2 表面接触角
乳胶表面的可湿性使用悬滴测角仪OCA 11通过测量水和纳米颗粒悬浮液（1000 μg/mL浓度）的接触角确定。对于每次测量，小心沉积6 μL液滴到材料表面，并立即记录数字图像。静态接触角使用ImageJ软件量化。所有测量在21°C进行，报告值代表三次独立重复的平均值。
2.5.3 表面张力
纳米颗粒分散体的表面张力使用动态接触分析仪（DCA-315）测量。每种分散体在去离子水中以目标浓度（250、500、1000和2000 μg/mL）制备，测试前轻轻混合确保均质性。对于每个样品，记录铂板以恒定速率浸入时的力，平衡表面张力（mN/m）从力-润湿几何计算。每次配方进行三次测量。
2.5.4 生物膜形成
对于接种物制备，将工作储备的一环转移到9 mL TSB中并在37°C孵育24小时。孵育后，培养物离心（6000 rpm, 10 min, 21°C）并用无菌0.1%蛋白胨水（PW）洗涤三次。沉淀重悬于TSB中，并在600 nm测量光密度（OD600）。细菌悬浮液使用预先建立的OD-CFU校准曲线调整到108CFU/mL，浓度通过在TSA上涂布系列稀释确认。十个乳胶试片（1 cm × 1 cm）如2.5.1所述制备、灭菌并放置在无菌100 mm培养皿中。30 mL细菌悬浮液（108CFU/mL in TSB）添加到每个培养皿中以完全浸没试片。样品在37°C静态孵育72小时以促进生物膜发展。为促进成熟、表面附着生物膜的形成而非瞬时细胞附着，每24小时轻轻更换50%用过的培养基为新鲜无菌TSB而不扰动试片，确保持续营养可用性同时保留已建立的细胞外聚合物物质（EPS）基质。这种延长孵育和营养补充对于成熟生物膜的发展是必要的。
2.5.5 纳米颗粒溶液对乳胶表面生物膜形成的影响
细菌接种物如2.5.4节所述制备，单核细胞增生李斯特菌（～108CFU/mL）暴露于分散在含有5% MeOH的PBS中的OEO-Fe-ZIF-8-HA、OEO-Ag-ZIF-8-HA或OEO-HA纳米颗粒。纳米颗粒浓度调整到MIC、MBC和2×MBC水平。无菌试片浸入这些悬浮液中并在37°C孵育72小时以促进生物膜形成。
孵育后，无菌取出试片并用3 mL无菌水冲洗三次以消除浮游和松散附着细胞，确保只有牢固附着的生物膜相关细胞保留在表面。这种冲洗步骤在去除非生物膜细胞方面的有效性已在表面相关生物膜研究中得到充分证实。试片然后转移到含有1 g无菌玻璃珠（500 μm）和5 mL 0.1% PW的无菌离心管中。生物膜细胞通过涡旋（Vortex-Genie 2）1分钟机械分离，该程序显示可破坏EPS基质并释放生物膜嵌入细菌而无显著活力损失。
所得悬浮液在缓冲蛋白胨水中系列稀释并在37°C有氧孵育72小时进行菌落计数。所有处理进行三次重复，PBS + 单核细胞增生李斯特菌和PBS + 5% MeOH分别作为阳性和溶剂对照。延长孵育、重复冲洗和机械破坏的组合确保回收细胞代表成熟生物膜群体而非松散附着或浮游细菌。
2.5.6 纳米颗粒溶液对已建立生物膜的影响
单核细胞增生李斯特菌生物膜孵育72小时，之后无菌取出试片并用3 mL无菌水冲洗三次以去除松散附着细胞。试片然后用纳米颗粒溶液（在PBS + 5% MeOH中制备）处理1小时或24小时 under static conditions. To simulate mechanical cleaning, a “scrubbing” treatment was also tested by vortexing coupons in 2 mL nanoparticle solution containing 100 mg sterile glass beads (500 μm) at 100 rpm for 1 min, followed by static incubation for 1 h. Controls were prepared identically using PBS + 5% MeOH.
After treatment, coupons were rinsed thrice with sterile water, placed in tubes with 1 g of sterile glass beads and 5 mL of 0.1% peptone water, and vortexed 1 min to detach biofilm cells. Aliquots (1 mL) were serially diluted in 0.1% PW, and 0.1 mL of suitable dilutions were spread on TSA plates for enumeration. Plates were incubated at 37°C for 24 h. The 1-h treatment was performed in triplicate on two separate days, and the 24-h treatment in three replicates.
2.6 OEO-HA纳米颗粒在芝麻菜叶片表面的应用
新鲜芝麻菜（Kroger）在4°C储存并在24小时内使用。去除损坏或枯萎的叶片。叶片接种单核细胞增生李斯特菌鸡尾酒（108CFU/mL）并浸入（1）OEO-Fe-ZIF-8-HA在875 μg/mL；（2）OEO-Ag-ZIF-8-HA在125 μg/mL；和（3）OEO-HA在1250 μg/mL纳米颗粒溶液中1、2、5和10分钟。我们实验室先前优化研究显示，浸渍处理在从表面去除细菌方面优于喷洒。微生物减少使用Oxford Listeria Agar量化。200 ppm氯溶液，通过稀释商业次氯酸钠（7.4% Clorox bleach）在去离子水中配制，作为化学消毒对照，而无菌蒸馏水在相同暴露时间作为阴性对照。氯浓度使用氯测试条验证，通过将条浸入氯溶液，然后取出并与颜色参考图表比较。残留游离氯浓度在使用氯测试条与绿叶蔬菜接触后测量。研究中，氯测试条用于在处理后立即快速验证游离氯水平，因为氯在绿叶蔬菜上有机物存在下快速衰减。氯溶液调整直到颜色匹配200 ppm氯参考水平。叶片然后在生物安全柜下每侧风干15分钟，分成10 g样品，并转移到无菌Whirl-Pak立式样品袋中。每个样品与90 mL无菌0.1% (w/v)蛋白胨水混合并手动按摩以分离表面细菌。存活细菌减少计算为未处理对照和处理样品之间的log CFU差异。所有测试进行三次重复，每次重复重复涂布以保证重现性。
芝麻菜叶片的质量属性，包括视觉外观和颜色，在样品制备当天（第0天）和样品制备后第1、3和5天在21°C评估。芝麻菜叶片的颜色变化使用LabScan XE 16437色度计（HunterLab Inc.）操作Universal Software version 3.80评估。仪器在分析前用标准黑白参考瓷砖校准。测量在21°C进行，每个样品进行三次读数以确保准确性。结果在CIE Lab*颜色空间中表达。
虽然OEO通常因其抗菌效能而被认可，但其强烈香气在升高浓度下可能影响感官感知。虽然处理过的芝麻菜未观察到可见质量恶化，但本研究未进行正式感官评估。未来工作应包括感官分析以确定消费者可接受阈值并优化商业应用的配方浓度。
2.7 统计分析
所有实验使用完全随机设计进行，每种处理三个独立生物重复。每个生物重复由在不同日子处理的单独制备样品组成。对于微生物试验，每个重复重复涂布，菌落计数在统计分析前平均。物理化学和细胞毒性测量每次配方进行三次独立测量，结果报告为平均值±标准差（SD）。使用JMP Pro 17软件进行统计分析。使用单向方差分析（ANOVA）评估处理效应，随后在检测到显著差异时进行Student's t检验成对比较，统计显著性定义为p < 0.05。
3 结果与讨论
3.1 纳米颗粒表征
3.1.1 SEM与MAP
SEM和互补MAP分析揭示了OEO-Ag-ZIF-8-HA、OEO-Fe-ZIF-8-HA和OEO-HA纳米颗粒的独特形态和组成。OEO-Ag-ZIF-8-HA显示均匀多面体结构，具有光滑、明确表面（100–200 nm），表明Ag+掺入保留了ZIF-8结晶度并增强了表面稳定性。相比之下，OEO-Fe-ZIF-8-HA显示更粗糙、略微拉长颗粒与部分团聚，归因于Fe2+替代扭曲了Zn-N配位并减缓晶体生长。OEO-HA出现无定形和密集团聚，由于缺乏金属配位中心和HA与OEO之间的强氢键，降低了孔隙率。
MAP进一步验证了关键元素在所有纳米颗粒表面的均匀分布。OEO-Ag-ZIF-8-HA显示Ag和Zn与C和O的均匀共定位，验证了成功的Ag掺入和HA包被；分散的Ag表明有效的替代或表面锚定，支持持续离子释放。OEO-Fe-ZIF-8-HA显示重叠的Fe、Zn和N信号，确认Fe2+整合到框架内和潜在氧化还原协同作用。OEO-HA图谱仅显示来自HA和OEO的C和O，确认其非金属、无定形性质。总体，SEM和映射结果验证了成功的合成、均匀金属掺入和所有配方中有效的HA整合。
3.1.2 TEM
TEM揭示了OEO-Ag-ZIF-8-HA、OEO-Fe-ZIF-8-HA和OEO-HA纳米颗粒之间的清晰形态差异。OEO-Ag-ZIF-8-HA呈现明确的多面体结构，具有光滑表面和轻微团聚，表明Ag+维持了ZIF-8结晶度但引起轻微晶格畸变。颗粒高度分散，平均低于150 nm，反映了Ag+诱导成核限制了晶体生长。OEO-Fe-ZIF-8-HA显示更不规则、拉长颗粒与更粗糙表面，与Fe2+替代破坏晶体对称性和促进各向异性生长一致。相比之下，OEO-HA形成准球形、无定形团聚体，典型于封装OEO液滴的HA基质。所有样品显示薄、均匀的HA包被，增强了分散性，减少了团聚，并确认了对于生物相容性和胶体稳定性关键的有效表面修饰。
3.1.3 FTIR
OEO-Fe-ZIF-8-HA、OEO-Ag-ZIF-8-HA和OEO-HA的FTIR光谱验证了金属掺杂ZIF-8框架在OEO-HA基质内的成功整合。在OEO-HA中，3200–3400 cm?1处的宽谱带对应于O-H/N-H伸缩，确认了HA与OEO酚类（如香芹酚和百里香酚）之间的氢键。2920和2850 cm?1处的峰指示OEO的C-H伸缩，而1730（C=O）、1650（酰胺I）和1550 cm?1（酰胺II）处的吸收反映了HA的羧基和酰胺基团。1410–1040 cm?1处的信号归因于糖类和酚类结构的C-O/C-O-C振动。
对于OEO-Fe-ZIF-8-HA和OEO-Ag-ZIF-8-HA，O-H/N-H谱带移动到较低波数且强度降低，指示HA羟基/羧基与金属中心之间的配位。420–450 cm?1附近的新吸收对应于金属-N和金属-O键，确认了金属成功掺入ZIF框架。OEO-Ag-ZIF-8-HA显示更强的1000–1500 cm?1谱带，反映了Ag对O/N原子的更高亲和力，而Fe掺杂产生更宽、强度较低的峰，由于部分无定形化。保留的OEO峰在2920、1730和1040 cm?1确认了基质内精油的稳定性。总体，这些光谱特征验证了强有机-无机键合和稳定、金属掺杂混合纳米结构的形成。
3.1.4 XRD分析
OEO-Fe-ZIF-8-HA、OEO-Ag-ZIF-8-HA和OEO-HA的XRD图案清晰区分了无定形OEO-HA基质与结晶金属掺杂复合材料。OEO-HA显示2θ = 9–20°处的宽晕，确认其非结晶聚合物性质，典型于HA，并进一步被OEO掺入破坏，增强了溶解性和分散性。
OEO-Fe-ZIF-8-HA和OEO-Ag-ZIF-8-HA均在2θ ≈ 7.3°、10.4°、12.7°、14.7°、16.4°、18.0°、24.5°、26.7°、29.6°和32.4°处显示尖锐反射，特征于ZIF-8的方钠石型结构。与原始ZIF-8相比，峰强度略微降低，表明由于金属掺入引起的轻微晶格畸变或部分无定形化。在OEO-Fe-ZIF-8-HA中，更宽的峰指示Fe2+替代Zn2+和长程有序的轻微破坏，而OEO-Ag-ZIF-8-HA保留更尖锐反射，暗示Ag+定位在表面或孔内而非晶格位点。两种复合材料中保留的ZIF-8衍射谱确认
