《MedComm》：State-of-the-Art Strategies for Circular RNA in Cancers: Opportunity and Challenge
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本综述系统阐述了环状RNA（circRNA）在癌症中的最新研究进展，重点聚焦其作为新型生物标志物、治疗靶点及circRNA疫苗的临床转化潜力。文章深入解析了circRNA的生物发生、降解机制及功能多样性（如ceRNA、蛋白支架、编码功能肽等），并探讨了人工智能在加速其发现与应用中的重要作用，为circRNA在肿瘤诊断、靶向治疗和免疫治疗领域的应用提供了前沿视角。
1 引言
环状RNA（circRNA）是一类具有共价闭合环状结构的非编码RNA，其显著特征包括卓越的稳定性和精确的时空调控。过去它们曾被视为剪接副产物，如今已成为重要的分子调控因子。除了众所周知的作为microRNA（miRNA）海绵的功能外，circRNA还能作为蛋白质支架、转录调控因子，甚至功能肽合成的模板。全球癌症流行病学持续成为关键的研究重点。根据世界卫生组织最新评估，2022年全球新发癌症病例1996万例，癌症相关死亡974万例。2013年，两项开创性研究阐明了circRNA作为竞争性内源RNA（ceRNA）的分子机制，首次明确证实circRNA通过其海绵效应调控miRNA活性。这些里程碑式的发现重塑了我们对circRNA的理解，将其从“剪接错误”提升为一类多样化的内源性调控RNA分子。
2 circRNA的生物合成
2.1 circRNA的环化机制
circRNA的生物合成、降解和细胞间通讯在人类中表现出显著的机制多样性。不同的circRNA亚型经历不同的形成和周转模式。其环化机制主要包括经典反向剪接、套索驱动的环化以及RNA结合蛋白（RBP）依赖的环化机制。经典反向剪接过程中，前体mRNA通过下游外显子的5'剪接供体位点与上游外显子的3'剪接受体位点之间的共价键形成环状结构。套索驱动的环化则始于前体mRNA剪接过程中的外显子跳跃事件。某些RBP可通过识别前体mRNA侧翼内含子内的特定基序，通过诱导二聚化或桥接互补序列来促进反向剪接。
2.2 circRNA的分类
大多数文献将circRNA分为三种主要类型：外显子circRNA（EcircRNA）、外显子-内含子circRNA（EIcircRNA）和内含子circRNA（ciRNA）。近期研究表明，circRNA不仅包括反义circRNA，还包括基因间circRNA。大多数已鉴定的circRNA是外显子circRNA和内含子circRNA。尽管circRNA的剪接主要发生在细胞核内，但EcircRNA主要被输出到细胞质，而CiRNA则保留在细胞核内。
2.3 circRNA的降解机制
circRNA的降解途径多样。核糖核酸酶L（RNase L）依赖性降解途径在病毒感染期间介导circRNA的全面降解。DIS3（染色体传输保真度蛋白3）是一种双功能内切/外切核糖核酸酶，在未感染细胞中维持circRNA稳态。Ago2和GW182等基因也通过不同机制参与circRNA衰变。此外，N6-甲基腺苷（m6A）依赖性降解途径中，YTHDF2识别m6A修饰并招募衔接蛋白HRSP12以及RNase P/MRP内切核酸酶复合物至circRNA特定位点，导致其精确切割和随后快速降解。
2.4 circRNA的核输出机制
circRNA主要在细胞核内通过反向剪接产生。然而，其功能角色（如作为miRNA海绵、与蛋白质相互作用或进行翻译）需要精确的亚细胞定位，主要是在细胞质中，尽管有一小部分保留在细胞核内。Ran-GTP作为一种小GTP酶，形成细胞内浓度梯度，为各种核质运输过程提供方向性信号。Exportin-2（XPO2）作为核输出受体，介导RNA分子从细胞核到细胞质的转运。值得注意的是，XPO2是circRNA核输出的唯一输出受体，但它不直接结合circRNA。该过程关键依赖于衔接蛋白IGF2BP1和/或IGF2BP2。
2.5 circRNA的细胞间运输机制
新兴证据表明，circRNA不仅具有细胞内功能，还通过细胞外分泌和被邻近或远处细胞摄取参与细胞间通讯，在发育、免疫和致癌过程中发挥关键作用。这种细胞间运输主要由细胞外囊泡（EV）介导。外泌体是EV的一个主要亚型，由各种细胞类型分泌，作为转移脂质、蛋白质、DNA和ncRNA的载体。被受体细胞摄取后，外泌体来源的circRNA可以发挥调控功能，最显著的是通过其miRNA海绵活性。
3 circRNA的特征
3.1 高稳定性
circRNA通过前体mRNA的反向剪接产生，形成共价闭合的环状结构，缺乏线性RNA所具有的5'帽子和3'多聚腺苷酸尾。这种独特的拓扑结构使circRNA能够逃避脱腺苷化、去帽和外切核酸酶降解。定量研究显示，circRNA的半衰期显著长于其同源线性RNA。因此，circRNA被认为在体液（如血浆、外泌体和尿液）中稳定存在。
3.2 组织特异性
大量研究证实，circRNA在真核组织中普遍表达，在哺乳动物脑和骨骼肌中显著富集。肿瘤特异性circRNA表达表现出显著的异质性。例如，circFAM53B在乳腺癌组织中特异性富集，但在正常乳腺中检测不到。CircE7是唯一已鉴定的HPV编码的circRNA，仅在HPV阳性头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中表达。
3.3 时空异质性
circRNA的异常稳定性和组织特异性为功能研究提供了坚实基础，而其表达模式在各种生物学背景下表现出时空动态性。多项肿瘤研究证实了circRNA的时空异质性。例如，在神经胶质瘤中，一种NEIL3衍生的circRNA在肿瘤组织中上调，其表达水平与病理分级（I–IV级）呈正相关。一项开创性研究利用空间分析技术研究了ciRS-7在结肠癌组织中的分布，意外地发现ciRS-7并非定位于癌细胞内部，而是在肿瘤微环境（TME）的基质细胞中高表达。
4 circRNA的功能机制
4.1 竞争性内源RNA
circRNA作为分子海绵，通过竞争性结合miRNA，阻止miRNA与靶基因mRNA的3'非翻译区（UTR）结合，从而解除对靶基因的抑制。这种复杂的circRNA–miRNA–mRNA调控轴在多种癌症类型的肿瘤发生和进展中产生深远的生物学效应。
4.2 circRNA–RBP相互作用模式
RBP是一类特异性与RNA分子相互作用的蛋白质。首先，circRNA可以特异性结合RBP，从而影响它们与其他蛋白质的相互作用。其次，circRNA可以与特定蛋白质相互作用，以失调其天然功能或引发新的生物学效应。第三，circRNA可以结合特定的顺式调控元件，以调控转录因子或表观遗传修饰，从而改变基因表达。
4.3 circRNA编码蛋白质
近期研究表明，一些circRNA可以进行翻译。由于缺乏5'帽子和3'末端，circRNA翻译通过帽子非依赖性机制进行。内部核糖体进入位点（IRES）介导的翻译机制在circRNA中广泛存在。circRNA翻译的另一种机制由m6A介导。研究发现，单个m6A位点可有效招募43S复合物以启动翻译。
5 circRNA在肿瘤中的生物学功能
5.1 circRNA在肿瘤生长和增殖中的作用
某些circRNA主要通过失调代谢通路来调控肿瘤增殖。例如，circRNF13病理性地在鼻咽癌（NPC）组织和细胞系中下调。机制上，circRNF13上调SUMO2蛋白表达，抑制糖酵解通量，从而抑制AMPK–mTOR信号轴，最终减弱肿瘤增殖。circRNA还通过调控细胞周期进程和凋亡来调节肿瘤生长。
5.2 circRNA在肿瘤免疫逃逸中的作用
免疫系统在识别和清除异常细胞、维持细胞稳态和防止恶性转化方面起着至关重要的作用。肿瘤免疫逃逸是一种病理状态，肿瘤通过改变抗原呈递、创建免疫抑制微环境和抑制免疫细胞功能等多种策略绕过免疫监视机制，使癌细胞得以存活。新兴证据强调特定的circRNA是这些免疫逃逸途径的关键调节因子。
5.3 circRNA在肿瘤侵袭和转移中的作用
虽然原发性肿瘤构成重大威胁，但其对患者的危险相对有限，而肿瘤侵袭和转移是临床死亡的主要原因。特定的circRNA通过调节上皮间质转化（EMT）、促进血管生成和淋巴管生成以及建立转移前龛等过程，在转移进展中起关键作用。
5.4 circRNA在肿瘤细胞死亡中的作用
细胞死亡是维持组织稳态的基本机制，其失调与癌症发病机制密切相关。靶向肿瘤细胞死亡是一种有前景的治疗策略，越来越多的证据表明circRNA在细胞死亡途径中起关键调控作用。
5.5 circRNA在肿瘤微生物组中的作用
肿瘤内存在一个复杂的微生物生态系统，包括细菌、真菌和病毒，统称为肿瘤内微生物群。这个微生物群落通过调节免疫调控、炎症反应和代谢重编程在肿瘤进展中起关键作用。迄今为止，至少在33种不同的人类癌症类型中检测到此类微生物群落。
5.6 circRNA与代谢重编程
代谢重编程是肿瘤细胞的一个标志，其特征是葡萄糖、氨基酸和脂质代谢的改变，以支持快速增殖、应激适应和微环境重塑。越来越多的证据表明，circRNA通过作为miRNA海绵、与蛋白质相互作用或编码短肽，成为这些代谢途径的关键调节因子。
5.7 circRNA调控细胞衰老
细胞衰老代表了一个贯穿生物体一生的基本生物学过程，维持衰老细胞清除和新细胞增殖之间的微妙平衡对于生理稳态至关重要。新兴证据强调这一过程是多种疾病的关键致病驱动因素，从神经退行性疾病和心血管疾病到致癌作用，而circRNA成为这些调控网络中的关键参与者。
5.8 circRNA调控表观遗传修饰
表观遗传修饰是基因功能的可遗传改变，不涉及底层DNA序列的变化。这些包括DNA和RNA甲基化、组蛋白修饰以及由ncRNA介导的转录后调控。此类机制允许共享相同遗传背景的细胞获得不同的功能身份。越来越多的证据表明，circRNA通过与DNA、蛋白质和其他RNA的复杂相互作用参与这些过程，从而对肿瘤的发生和进展产生深远影响。
6 circRNA作为早期肿瘤诊断的有前景的生物标志物
6.1 早期肿瘤进展中circRNA表达的时序动态
癌症的发展是一个复杂而漫长的过程，通常从正常组织经历炎症反应和癌前病变发展到早期癌症，往往持续数十年。因此，研究这种多步骤进展背后的分子机制至关重要。
6.2 circRNA的无创检测
多组学技术的进步促进了众多有前景的肿瘤学生物标志物的发现和临床转化。研究表明，circRNA表达与组织稳态、细胞动力学和肿瘤发生密切相关，使circRNA成为包括癌症在内的各种病理学的可行生物标志物。在临床实践中，无创生物标志物和液体活检技术被广泛用于实时监测疾病进展和治疗反应。circRNA在唾液、血浆、血清和外泌体等体液中表现出稳定的表达和相对较高的丰度，使其成为基于无创液体活检的癌症检测的理想候选者。
7 circRNA及其编码蛋白作为治疗靶点
7.1 跨模型的治疗靶向
大量利用体外细胞培养和细胞系来源的异种移植（CDX）模型的研究表明，靶向circRNA或其编码蛋白可以有效抑制肿瘤进展和转移，同时逆转肿瘤细胞对化疗、放疗和免疫治疗的耐药性。临床前研究采用患者来源的类器官（PDO）和患者来源的异种移植（PDX）模型进一步强调了靶向circRNA相关通路在癌症治疗中的临床转化潜力。
7.2 circRNA重塑CAR-T治疗领域
circRNA正在多个层面重塑CAR-T治疗的格局和实践。大量研究表明，在适应性免疫水平上，circRNA可通过上调免疫检查点分子损害T细胞功能，或通过减少T细胞向肿瘤组织的浸润降低其抗肿瘤活性。相反，越来越多的研究强调了circRNA在过继性细胞治疗中的独特应用潜力。
7.3 递送系统
目前，利用circRNA的癌症治疗可分为三种主要方法。第一种方法是递送siRNA、反义寡核苷酸或CRISPR–Cas13a以沉默致癌circRNA。第二种方法是构建并递送肿瘤抑制性circRNA的过表达载体。第三种方法是递送编码功能蛋白的circRNA以参与癌症治疗。这些基于circRNA的癌症疗法的关键在于将目标分子精确有效地递送到目标组织或细胞。
7.4 circRNA在治疗中的合成
circRNA的大规模合成对于推进circRNA疗法的广泛应用至关重要。体外circRNA合成主要采用三种方法：化学合成、使用DNA或RNA连接酶的酶介导合成，以及基于自剪接内含子的核酸酶方法。除了体外合成，circRNA也可以在体内产生。circRNA结构通常包含IRES、编码区和调控发夹环。优化这些结构可增强蛋白质表达、降低免疫原性并提高稳定性，最终提高circRNA疗法的整体疗效。
8 circRNA临床转化的机遇
8.1 基于circRNA的疫苗的应用与前景
当前可用的疫苗分为五大类：灭活疫苗、病毒载体疫苗、DNA疫苗、mRNA疫苗和新兴的基于circRNA的疫苗，每类代表不同的免疫策略技术平台。circRNA的共价闭合环状结构赋予其与线性RNA相比的高稳定性和延长的半衰期。在翻译过程中，circRNA利用IRES启动滚环翻译（RCT），能够持续产生重复抗原表位，从而增强免疫原性同时减少dsRNA产生。因此，基于circRNA的疫苗代表了一个快速发展的研究领域。
8.2 技术创新：单细胞circRNA测序揭示肿瘤异质性
在单细胞水平上精确解析生物系统及其在疾病中的失调需要进行多参数分析。虽然单细胞测序由于多组学分析平台的进步已成为肿瘤学研究的重要组成部分，但在单细胞分辨率下分析circRNA仍然具有挑战性。
8.3 转化优先事项：整合跨癌症类型的数据库
高通量测序技术的快速发展促进了多个综合性circRNA数据库的开发，这些数据库致力于癌症研究，显著推进了泛癌circRNA研究。通过整合不同癌症类型的circRNA表达谱、分子特征和临床信息，这些数据库为系统探索circRNA在肿瘤发生中的功能作用提供了宝贵的资源。
8.4 人工智能在circRNA中的作用
在过去的十年中，人工智能（AI）引领了医学的新时代，成为临床决策支持和生物医学预测分析不可或缺的工具。通过利用强大的计算能力，AI能够高效处理和分析现代生物学产生的高通量测序数据。各种深度学习架构能够预测新的药物靶点和疾病风险，而AI驱动的框架在circRNA筛选、序列注释和功能表征中起着关键作用。
9 circRNA临床转化面临的挑战
9.1 circRNA标准化研究中的挑战
虽然高通量测序技术和算法创新的快速发展显著加速了circRNA研究，但这些发展也给建立标准化的实验和分析框架带来了挑战。
9.2 circRNA临床转化研究中的伦理问题
临床转化研究是基础医学发现与一线临床实践之间的关键桥梁。当前circRNA转化的努力主要集中在诊断生物标志物、癌症免疫治疗、药物开发和创新疫苗设计上。然而，该领域仍处于起步阶段，大多数circRNA相关研究仍处于临床前阶段。
10 结论与展望
最初，circRNA被认为是翻译过程中的“噪音”。然而，随着技术的进步，发现circRNA具有多种功能，包括作为miRNA海绵、调控亲本基因转录以及作为蛋白质翻译模板。这些多样化的功能与各种生理和病理过程相关。由于其独特的结构特征，circRNA在体内表现出稳定的表达和组织特异性，使其成为潜在的生物标志物。阐明circRNA的详细生物学功能需要高精度地绘制其亚细胞定位的空间图谱。鉴于其相对于mRNA的卓越结构完整性及其在体内的多效性功能模式，circRNA是工程化治疗载体的有希望的候选者。在过去的十年中，AI已成为生物医学研究中的强大工具。未来的努力需要扩大基于circRNA的治疗方法在不同肿瘤学背景下的转化研究。
