通过对先兆子痫滋养层的单细胞RNA测序（scRNA-seq），发现EBI3、COL17A1、miR-27a-5p和miR-193b-5p是缺氧的标志物；同时验证了Neuradapt作为氯化钴替代物的优越性

《Placenta》：scRNA-seq of preeclamptic trophoblasts identifies EBI3, COL17A1, miR-27a-5p, and miR-193b-5p as hypoxia markers: validation of neuradapt as a superior mimetic to cobalt chloride

胎盘缺氧相关分子标志物及化学模拟物效能评估

叶夫根尼·克尼亚泽夫|蒂穆尔·库拉金|伊万·安蒂彭科|亚历山大·托涅维茨基

俄罗斯莫斯科国立高等经济学院生物与生物技术学院

摘要

背景

先兆子痫（PE）影响了2-8%的妊娠病例，其特征是胎盘缺氧和HIF通路激活，尤其是在早发性先兆子痫（eoPE）中。像氯化钴（CoCl₂）和氧喹啉衍生物这样的化学模拟物可以在体外模拟滋养层缺氧，但它们在再现PE基因谱型方面的准确性仍不清楚。将患者组织分析与实验模型相结合可能会揭示共同的标志物，并验证生理学上相关的机制。

方法

我们分析了10例eoPE、7例晚发性PE以及相应对照组胎盘的scRNA-seq数据，识别出了绒毛滋养层细胞、合胞滋养层细胞和绒毛外滋养层细胞（EVT）。BeWo b30细胞被暴露于CoCl₂（300 μM）或氧喹啉衍生物neuradapt（5 μM）24小时以诱导缺氧。通过RNA-seq和qPCR验证以及小RNA-seq来量化mRNA和microRNA的变化；PROGENy软件用于推断通路活性。

结果

scRNA-seq显示eoPE中的缺氧激活最为显著，EVT的活性最高。有九个基因在所有类型的滋养层细胞中均上调（EBI3, CST6, FN1, RFK, COL17A1, LDHA, PKP2, RPS4Y1, RPS26）。体外实验中，neuradapt诱导的缺氧反应比CoCl₂更为特异（差异表达基因分别为1,284个和3,032个）。重要的是，EBI3, FN1和COL17A1在组织和neuradapt处理后的细胞中显示出一致的上调趋势，而CoCl₂则产生了相反的模式。microRNAs hsa-miR-27a-5p和hsa-miR-193b-5p在两种模型中均显著升高；hsa-miR-9-5p和hsa-miR-92b-3p的3'-异构体被确定为与缺氧相关的。

结论

EBI3, COL17A1、miR-27a-5p和miR-193b-5p被认为是滋养层缺氧的标志物。Neuradapt（一种选择性的HIF脯氨酰羟化酶抑制剂）提供了一个比CoCl₂更符合生理学的体外模型，能够再现PE胎盘中的转录组特征。这种综合方法有助于深入理解PE的病理生理学和治疗方法。

引言

先兆子痫（PE）是一种严重的妊娠并发症，影响全球2-8%的妊娠病例，是导致孕产妇和围产期发病率和死亡率的主要原因[1]。这种多系统疾病源于胎盘形成缺陷，表现为绒毛外滋养层侵袭不足和螺旋动脉重塑受损，从而引发胎盘缺血和缺氧[2],[3]。PE具有临床异质性，存在不同的亚型。早发性PE（eoPE；妊娠<34周）以明显的胎盘功能障碍和HIF-1α介导的缺氧反应通路激活为特征，而晚发性PE（loPE）的胎盘相关特征则不那么明显，这提示可能存在不同的病理生理过程[4]。

体外滋养层模型被广泛用于研究PE的分子机制。BeWo绒毛膜癌细胞系常被用作滋养层模型的代表。它是少数几种保留了广泛胎盘功能的滋养层细胞系之一，包括激素分泌和功能分化能力[5]。特别是BeWo b30亚克隆表现出显著的表型可塑性，使其成为模拟多种滋养层谱系的多功能工具。在基础状态下，这些细胞形成紧密连接的单层结构，模拟绒毛滋养层细胞（VCT）和胎盘屏障的极化上皮。在cAMP（环腺苷单磷酸）刺激下，这些细胞融合形成多核结构，类似于合胞滋养层细胞（SCT）[6]。此外，尽管BeWo b30细胞具有上皮细胞特性，但仍保留了绒毛外滋养层（EVT）的侵袭能力，这种能力可以通过环境信号进行调节[7]。这种能够再现三种主要滋养层亚群（VCT、SCT和EVT）关键特征的能力，使BeWo b30克隆成为识别不同滋养层分化状态下共同缺氧反应的独特模型。然而，作为转化的癌细胞系，BeWo b30在某些关键方面与原代滋养层细胞有所不同，包括无限的增殖寿命、主要组织相容性复合体（MHC）表达改变以及独特的代谢特征[8]。在将体外研究结果外推到复杂的PE胎盘多细胞环境时，认识到这些差异是必要的。

为了在滋养层模型中模拟缺氧条件，经常使用氯化钴（CoCl₂）和氧喹啉衍生物等化学模拟物[9],[10],[11],[12],[13]。虽然CoCl₂是稳定HIF-1α的标准试剂，但其作用具有高度多效性[14]。Co²⁺取代HIF脯氨酰羟化酶（PHDs）催化位点上的Fe²⁺是经典的稳定机制；然而，动力学研究表明，在生理条件下Co²⁺可能无法有效置换酶结合的Fe²⁺，这挑战了直接替代模型[15]。相反，证据表明CoCl₂可能主要通过氧化抗坏血酸（PHD活性的必需辅因子）来发挥作用，而不是通过直接置换金属[16]。此外，CoCl₂还会产生显著的脱靶效应：它会产生活性氧物种并消耗细胞内谷胱甘肽[20]，损害线粒体膜电位和ATP生成[21],[22]，独立于缺氧情况诱导DNA损伤[23],[24]，并通过竞争金属转运蛋白来扰乱铁的稳态[25],[26]。

作为更特异的缺氧模型，氧喹啉衍生物（ODs）被开发为选择性的PHD抑制剂。与广泛螯合细胞内铁的铁螯合剂不同（这些螯合剂会干扰线粒体代谢并引发氧化应激），先进的ODs仅在与PHD活性位点结合的Fe²⁺离子上起作用[27]。氧喹啉环7位上的特定取代基决定了化合物的选择性：在本研究中使用的neuradapt分子（化合物4896-3212）中，一个特化的“分支尾部”模拟了HIF-1α的氧依赖性降解结构域[28],[29]。这一结构特征使抑制剂能够通过氢键与PHD2活性位点的Asp254结合，从而具有高结合特异性，区别于其他OD变体[30]。因此，neuradapt选择性地阻断HIF-1α的羟基化，使其稳定并激活缺氧反应通路，而不会产生钴或通用螯合剂所伴随的明显脱靶毒性。

尽管存在这些局限性，化学缺氧模型仍然是PE研究中用于解析分子通路的有用工具，最近利用CoCl₂和其他模拟物研究滋养层应激反应的研究就证明了这一点[31],[32],[33],[34]。然而，CoCl₂和ODs在多大程度上能够准确再现PE胎盘组织的复杂基因表达谱型仍不清楚。虽然胎盘裂解物的批量RNA-seq为PE研究提供了基础，但它存在一个关键限制：它平均了滋养层、免疫细胞和基质成分的基因表达。这种“批量”信号掩盖了细胞类型的特异性反应，使得与纯体外滋养层模型的比较变得复杂。单细胞RNA测序（scRNA-seq）通过在单个细胞水平上解析胎盘异质性，能够区分VCT、SCT和EVT的特异性特征[35],[36]。通过体内定义这些谱系特异性的缺氧反应，scRNA-seq提供了评估CoCl₂和neuradapt在多大程度上再现PE滋养层分子特征的必要高分辨率基准。

我们使用scRNA-seq数据研究了PE中三种滋养层亚群的基因表达变化，并将这些谱型与暴露于CoCl₂或neuradapt的BeWo b30细胞进行了比较。此外，为了评估我们的发现的实际应用潜力，我们特别评估了先前报道在PE妊娠胎盘外泌体（EVs）中富集的mRNA和microRNA的表达情况。通过将这些发现与已知的囊泡相关转录本进行交叉参考，我们旨在确定体外化学缺氧诱导的分子谱型是否与体内应激胎盘的生物标志物一致。我们的最终目标是对比原代滋养层亚群和缺氧处理细胞系的分子反应，以识别PE中缺氧扰动的稳健且可能被分泌的生物标志物。

章节片段

单细胞RNA-seq数据获取

scRNA-seq数据来自Admati等人（2023年）在10x Genomics Chromium平台上生成的公开数据集[37]。该队列包括10例eoPE（平均分娩周数31.8 ± 3.7周）、7例loPE（平均分娩周数38.4 ± 1.5周）以及9例孕龄匹配的正常血压对照组（包括3例早产（31.0 ± 4.3周）和6例足月分娩（39.0 ± 0.6周）。PE的临床定义遵循ACOG标准

滋养层亚群划分揭示了早发性和晚发性先兆子痫中的簇分布差异

为了建立PE中滋养层缺氧的分子基准，我们首先分析了scRNA-seq数据集[37]以划分PE中的滋养层亚群。原始研究分析了10例eoPE胎盘（在妊娠34周之前诊断）以及3例孕龄匹配的正常血压对照组和7例loPE胎盘及其对应的6例正常血压对照组。他们定义了以下滋养层亚群：增殖期的VCT（VCT_PROLIFERATING）和两个 postmitotic VCT 簇（VCT_1 和 VCT_2）；小型

讨论

我们的综合分析为早发性先兆子痫（eoPE）中的胎盘缺氧定义了一个精确的分子基准，并严格评估了常见体外模型的准确性。我们证明，尽管CoCl₂和特定的PHD抑制剂neuradapt都能稳定HIF-1α，但它们诱导的转录图谱存在显著差异。重要的是，neuradapt准确再现了PE胎盘的特异性炎症（TGF-β/TNF-α）和基因表达特征（EBI3, COL17A1），

局限性

我们的研究存在几个需要考虑的局限性。首先，虽然scRNA-seq提供了高分辨率的转录数据，但分析的临床队列规模（N=10例eoPE，N=7例loPE）相对较小。此外，在微流控捕获过程中系统性去除多核合胞滋养层细胞——这是当前scRNA-seq协议的一个已知限制——可能导致对合胞层反应的描述不完整，尽管我们通过分析存活的SCT_PSG部分缓解了这一问题

CRediT作者贡献声明

伊万·安蒂彭科：撰写 – 审稿与编辑、验证、研究、数据分析、概念化。亚历山大·托涅维茨基：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源管理、项目管理、方法学、资金获取、概念化。叶夫根尼·克尼亚泽夫：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、项目管理、方法学、研究、数据分析、概念化。蒂穆尔·库拉金：撰写 –

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作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备本文时，作者使用了Perplexity AI工具来提高手稿的可读性和语言质量。使用该工具后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对发表的内容负全责

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