《Plant Physiology and Biochemistry》：TO-GCN Analysis Reveals the Salt Response Mechanism in
Carya illinoinensis and a Preliminary Exploration of the ‘CiPLATZ23-PIP2;8’ Module
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本研究针对薄壳山核桃（Carya illinoinensis）盐胁迫响应机制不明的瓶颈问题，通过时间序列转录组学结合时间有序基因共表达网络（TO-GCN）分析，系统解析了盐胁迫下基因表达的动态调控规律。研究发现光合作用和通道蛋白相关基因显著富集，并鉴定出CiPLATZ23通过结合CiPIP2;8启动子抑制其转录。实验验证该模块参与ABA信号通路，过表达CiPLATZ23的拟南芥表现出ABA低敏感性。研究为木本油料作物抗逆育种提供了新靶点和理论依据。
随着全球气候变化和不合理灌溉加剧，土壤盐渍化已成为制约农业生产的重要障碍。薄壳山核桃作为高价值木本油料作物，兼具生态修复功能，但其盐适应分子机制尚不明确。培育耐盐品种对开发利用盐碱地具有重要意义。传统转录组分析方法难以捕捉基因互作网络的动态演化规律，而时间有序基因共表达网络（TO-GCN）技术为解析时序性调控级联提供了新思路。
本研究以两年生薄壳山核桃实生苗为材料，用600 mM NaCl处理模拟盐胁迫，通过RNA-seq获取9个时间点的转录组数据。表型观察发现盐胁迫导致叶片萎蔫和叶绿素含量显著下降。生理指标检测显示丙二醛（MDA）含量在第12天达到峰值，而过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性在第15天才达到最大值，表明抗氧化响应滞后于膜脂过氧化损伤。
研究人员采用TO-GCN方法构建了包含7,840个差异表达基因的共表达网络，将基因按表达轨迹划分为10个层级。富集分析发现L1/L2层级基因显著富集于光合作用相关GO条目，包括光系统II功能（GO:0016168）、叶绿素结合（GO:0046906）等。进一步筛选出11个光合作用相关转录因子，其共表达子网络普遍富集磷酸化相关功能。
值得注意的是，L1/L2基因中"通道活性"相关基因显著下调，聚类分析鉴定出3个高表达水通道蛋白基因：CiPIP1;4、CiPIP2;8和CiPIP2;5。启动子分析发现这些基因含有ABA响应元件（ABRE）和富AT序列。通过表达模式比对和双荧光素酶报告基因（DLR）实验，证实转录因子CiPLATZ23能结合CiPIP2;8启动子并抑制其转录活性。
深入机制研究发现，CiPLATZ23自身启动子也含有ABRE元件。ABA处理可诱导ProCiPLATZ23::GUS在本氏烟叶片中的表达，且外源ABA喷洒使核桃叶片中CiPLATZ23转录水平在24小时内持续升高。在拟南芥中过表达CiPLATZ23的株系表现出ABA低敏感性：在0.5 μM ABA处理下，转基因株系绿苗率（44%-64%）显著高于野生型（22%），且根系发育更好。
通过序列比对发现拟南芥AtPIP2;8与CiPIP2;8氨基酸序列相似度达79.02%。实验证实CiPLATZ23同样能结合AtPIP2;8启动子，在转基因拟南芥中抑制AtPIP2;8表达。酵母单杂和DLR实验进一步验证了这种跨物种调控的保守性。此外，对ABA信号通路"ABA-PYL-PP2C-SnRK2"基因家族的表达分析显示，盐胁迫显著激活了ABA通路相关基因，GO富集发现L3、L8、L9层级基因均富集ABA结合（GO:0010427）等术语。
主要技术方法
研究采用600 mM NaCl处理两年生薄壳山核桃实生苗，在9个时间点取样进行RNA-seq测序。使用TO-GCN算法构建时间有序共表达网络，通过DLR实验验证转录调控关系，利用农杆菌介导的瞬时转化和稳定遗传转化技术在本氏烟和拟南芥中进行功能验证，结合酵母单杂实验检测蛋白-DNA互作。
3.1 盐胁迫下表型与生理响应
盐处理24天后叶片出现明显萎蔫，叶绿素含量显著降低。MDA含量在第12天达到峰值，而CAT和POD活性在第15天达到最高，表明抗氧化系统的激活滞后于膜损伤。
3.2 测序数据质量评估
27个文库的清洁读数对在2100万-8410万之间，参考基因组比对率均高于96.23%。共检测到32,649个表达基因和85,586个转录本，其中包含30,170个新转录本。
3.3 差异表达基因时序动态
DEG数量呈现三相变化模式：0-12天逐渐增加，12-18天减少，18-24天部分恢复。S9和S12时期包含最多特有DEG（494和1,046个）。
3.4 时间有序基因共表达网络
以LOC122303663为种子基因构建TO-GCN，将7,840个基因划分为10个层级。L1/L2基因在0天表达最高且持续下调，L3-L5基因在3天达到峰值，L6-L7在6-9天峰值，L8-L9在12天峰值，L10在15天达到表达高峰。
3.5 盐胁迫显著影响光合系统
L1/L2基因显著富集于光合作用相关GO术语。鉴定出11个光合作用相关转录因子，其共表达网络显示磷酸化相关术语普遍富集。
3.6 盐胁迫显著影响水通道蛋白
通道活性相关基因普遍下调。CiPIP2;8启动子含有ABRE和富AT序列，与CiPLATZ23表达呈负相关。DLR实验证实CiPLATZ23抑制CiPIP2;8转录。
3.7 CiPLATZ23过表达拟南芥表现出ABA低敏感性
ProCiPLATZ23受ABA诱导激活。CiPLATZ23-OE株系在ABA处理下绿苗率和根系长度显著高于野生型。
3.8 CiPLATZ23在异源转化中调控AtPIP2;8
CiPLATZ23能结合AtPIP2;8启动子并抑制其表达，在拟南芥中重现了调控关系。
3.9 盐胁迫激活ABA信号通路
ABA通路关键基因表达显著上调，L3、L8、L9层级基因富集ABA相关GO术语。
本研究首次将TO-GCN分析应用于胡桃科经济树种，揭示了薄壳山核桃盐胁迫响应的时序性调控网络。发现CiPLATZ23通过抑制CiPIP2;8转录参与ABA信号通路，过表达CiPLATZ23可降低拟南芥对ABA的敏感性。研究不仅阐明了盐胁迫下光合作用和水分运输的调控机制，还为木本作物抗逆育种提供了关键靶点。建立的"CiPLATZ23-PIP2;8"调控模块为理解植物盐适应机制提供了新视角，对应对土壤盐渍化挑战具有重要理论价值和应用前景。
