基于橙胡萝卜细胞培养的创新生物刺激剂缓解西兰花种子盐胁迫的研究

《Plant Stress》：Amelioration of salt stress in broccoli seeds by an innovative biostimulant based on orange carrot cell cultures

气候变化导致的土壤盐渍化严重威胁全球粮食安全，尤其影响西兰花等作物的种子萌发。本研究通过诱变技术制备了一种富含植物甾醇和酚类化合物的橙胡萝卜细胞培养源生物刺激剂（OCB），并探究了其作为引发剂在盐胁迫下对西兰花种子萌发的促进作用。研究表明，OCB能够有效缓解盐胁迫引起的氧化损伤，调节激素和蛋白质组谱，从而提升种子活力与萌发效率。这项工作为开发稳定、高效的植物源生物刺激剂以应对农业逆境提供了新策略。

想象一下，一片原本富饶的农田，因为灌溉用水的盐分越来越高，土壤逐渐变得“咸”化，种子躺在这样的土壤里难以发芽，即便勉强破土，幼苗也羸弱不堪。这不是未来的科幻场景，而是当今全球，尤其是地中海沿岸等干旱半干旱地区正面临的严峻挑战——土壤盐渍化。它已成为限制作物产量、威胁粮食安全的主要非生物胁迫之一。在众多受影响的作物中，西兰花因其丰富的营养价值和巨大的经济效益而备受关注，其种子萌发阶段对盐分尤为敏感，常常成为生产的瓶颈。

为了应对这一难题，科学家们将目光投向了“种子引发”技术，即在播种前用特定溶液对种子进行温和处理，激活其代谢，为应对逆境提前“热身”。而在众多引发剂中，来源于高等植物的生物刺激剂因其富含多种生物活性化合物，能够调节植物生理、增强抗逆性，展现出巨大潜力。然而，传统植物提取物存在成分不稳定、受环境因素影响大等缺点。有没有一种方法，能获得成分稳定、均一且高效的植物源生物刺激剂呢？

发表在《Plant Stress》上的一项研究给出了一个创新性的答案。来自西班牙穆尔西亚大学的研究团队，独辟蹊径地利用植物细胞培养这一生物技术工具。他们不再依赖于整株植物的收成，而是将橙胡萝卜的细胞在实验室里进行悬浮培养。通过施加环糊精和茉莉酸甲酯这两种“激发子”进行处理，他们成功诱导细胞大量合成并积累特定的有益物质，从而制备出一种新型的橙胡萝卜细胞培养源生物刺激剂，简称为OCB。这种OCB富含植物甾醇（如菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇等）和酚类化合物（如丁香酚），其总蛋白和总酚含量均达到未激发处理产品的两倍以上。

为了验证OCB的效果，研究人员以商业西兰花种子为材料，用不同浓度的OCB溶液进行为期2小时的种子引发处理。随后，将这些处理过的种子置于含有100 mM氯化钠（模拟盐胁迫）的培养皿中进行萌发实验，并以未引发种子和仅用水引发的种子作为对照。研究团队系统评估了种子的萌发参数（平均萌发时间、萌发指数、活力指数、鲜重）、氧化应激标志物（过氧化氢H₂O₂、丙二醛MDA、脯氨酸）含量、内源植物激素谱，并利用基于液相色谱-串联质谱的定量蛋白质组学技术，深入分析了幼苗蛋白质组的差异变化。

本研究运用的几个关键技术方法包括：利用环糊精和茉莉酸甲酯激发子处理悬浮培养的橙胡萝卜细胞，制备富集生物活性化合物的生物刺激剂（OCB）；对西兰花种子进行不同浓度OCB的引发处理，并在100 mM NaCl条件下进行萌发实验；通过分光光度法测定H₂O₂、MDA、脯氨酸等氧化应激标志物；采用高效液相色谱-串联质谱联用技术对幼苗中包括生长素、赤霉素、脱落酸、茉莉酸等在内的多种植物激素进行定量分析；以及利用非标记定量蛋白质组学技术结合生物信息学分析，鉴定盐胁迫和OCB处理引起的差异表达蛋白及其富集的生物学通路。

研究结果：

3.1. OCB对西兰花种子萌发的生物刺激效应评估

在盐胁迫下，未引发种子和仅水引发的种子的幼苗活力指数和鲜重均显著下降。而用0.1%低浓度OCB引发处理，能完全逆转盐胁迫的负面影响，将活力指数和鲜重恢复至非胁迫条件下的水平。较高浓度的OCB（1%和10%）则未表现出此积极效果，表明其效应具有剂量依赖性。未激发的胡萝卜细胞产品在任何浓度下均无此缓解作用，证明了激发处理富集生物活性成分的必要性。

3.2. OCB对缓解盐胁迫效应的评估

盐胁迫导致西兰花幼苗中H₂O₂和MDA含量显著升高，表明氧化损伤加剧。OCB处理有效阻止了盐胁迫下H₂O₂的积累，并将MDA含量降低了11%。同时，盐胁迫下大量积累的渗透调节物质脯氨酸，在OCB处理幼苗中也维持在较低水平，表明OCB减轻了细胞的渗透和氧化压力。

3.3. OCB对盐胁迫下西兰花幼苗激素谱的影响评估

盐胁迫扰乱了幼苗的激素平衡，导致玉米素、赤霉素GA₄和GA₇、吲哚-3-丁酸以及褪黑素等激素水平上升。OCB预处理则显著改变了这一响应模式：它降低了盐胁迫下吲哚-3-丁酸、赤霉素（GA₃, GA₄, GA₇）以及脱落酸、茉莉酸甲酯、水杨酸和褪黑素等多种胁迫相关激素的水平。聚类分析和主成分分析进一步证实，OCB处理的盐胁迫幼苗在生理、生化和激素特征上更接近于非胁迫下的对照幼苗，而与未处理的盐胁迫幼苗显著分离。

3.4. 盐胁迫下OCB引发的蛋白质组变化

蛋白质组学分析揭示了分子层面的机制。在盐胁迫下，未引发幼苗中有56个差异丰度蛋白，其上调的蛋白主要富集于清除超氧化物自由基、活性氧代谢过程和解毒等生物学过程。OCB处理则显著改变了这一响应：在盐胁迫下，OCB处理幼苗仅产生34个差异丰度蛋白，数量远少于未处理幼苗。尤为重要的是，OCB处理抑制了盐胁迫通常诱导的一系列抗氧化酶（如过氧化氢酶、谷胱甘肽转移酶、过氧还蛋白、超氧化物歧化酶的不同亚型）的过度积累，使其水平恢复到与非胁迫对照相当的状态。此外，OCB处理幼苗中，与胁迫响应、信号检测过程相关的蛋白质积累下调，而与光合作用和翻译等过程相关的蛋白则有所上调。

研究结论与讨论：

本研究表明，通过植物细胞培养和激发子技术制备的橙胡萝卜源生物刺激剂OCB，是一种能有效缓解西兰花种子盐胁迫伤害的新型农业投入品。其核心机制在于其富含的酚类化合物和植物甾醇等抗氧化物质，能够直接或间接地减轻盐胁迫引发的氧化损伤，防止细胞膜脂质过氧化（表现为MDA降低）。这种预先的“抗氧化防护”使得种子在遭遇盐胁迫时，无需启动过于剧烈的防御反应。因此，幼苗避免了应激激素（如ABA、MJ、SA、MEL）的过度积累和大量抗氧化防御蛋白的合成“透支”，将更多资源用于生长代谢，从而维持了较高的萌发活力与幼苗生物量。

这项工作的重要意义体现在多个层面。在应用上，它提供了一种缓解盐胁迫对作物萌发阶段抑制的有效解决方案，尤其对于像西班牙穆尔西亚这样西兰花主产且受土壤盐渍化威胁严重的地区具有直接实用价值。在技术上，它成功展示了利用植物细胞培养系统生产生物刺激剂的优势：成分均一、稳定、不受季节和地理环境影响，为开发下一代标准化、高效能的植物源生物刺激剂开辟了新的技术路径。在科学上，研究从生理指标、氧化还原状态、激素网络到蛋白质组进行了多层次、系统的机制解析，深化了对于生物刺激剂如何通过调节植物内稳态来增强抗逆性的理解，即优秀的生物刺激剂并非单纯“强化”植物的所有应激反应，而是帮助其“更智慧、更经济地”应对胁迫，将胁迫信号控制在适宜范围，避免防御过度带来的生长代价。这项研究为应对气候变化下的农业可持续发展提供了有价值的科学依据和创新产品思路。