最近的研究建立了DNA长度与各种疾病发展之间的强烈相关性[1]。例如，在生物体的外周血浆中发现了具有非随机分布特征的高度降解DNA片段[2]、[3]。在健康个体中，这些片段通常表现出均匀的长度分布；然而，在病理条件下，如恶性肿瘤[4]、[5]，它们的分布可能会显著波动。就端粒生物学而言，健康新生儿的平均端粒长度在10,000到15,000个碱基对之间，随着年龄的增长自然缩短至5,000到7,000个碱基对[6]、[7]、[8]。相反，在遗传性疾病（如短端粒综合征[9]、[10]）中，端粒会异常且迅速缩短，常常在年轻成年期就低于健康阈值。这种现象通常预示着早衰症或其他严重疾病的早期发作[11]、[12]。因此，实时监测生物体中的平均DNA长度，包括端粒长度和游离DNA片段的分布[13]、[14]，可以作为恶性肿瘤和遗传性疾病的早期预警[15]、[16]。
传统的DNA长度检测技术，以定量聚合酶链反应（qPCR）[17]、[18]为代表，通过测量目标序列与单拷贝基因之间的拷贝数比来量化DNA长度，依赖于放大技术[19]。这种技术对于检测单个基因成分是有效的，但存在明显的局限性。首先，它需要在后期进行琼脂糖凝胶电泳，这依赖于已知长度的DNA标记物[20]。如果标记物的范围不匹配或其分辨率不足，很容易导致长度判断错误。其次，电泳结果不仅受DNA长度的影响，还受样品DNA的电荷、分子量和结构等因素的影响，从而降低了准确性[21]、[22]。特别是很难区分具有相同长度但不同分子量的DNA[23]。同时，这种方法需要使用染料[24]，这要求胶体中的样品浓度达到一定水平，从而增加了分析微量样本的难度。此外，它不能直接表征DNA长度，必须通过拷贝数比间接推断，这大大增加了系统错误的概率并降低了结果的准确性。
对于混合片段样本，qPCR受到全基因组扩增偏差和扩增过程中覆盖不足的影响，导致最终样本与原始样本之间的一致性降低[25]。这导致DNA物理长度的表征出现显著偏差，这是一个难以突破的技术瓶颈。此外，该技术操作繁琐，需要输入昂贵的试剂，如引物、酶和染料，限制了其应用[26]、[27]。
为了解决这些挑战，已经开发了几种新的策略。虽然这些方法弥补了PCR在检测超短DNA方面的不足，但它们只能检测100~130 ?范围内的DNA长度变化，因此实际应用性有限。此外，它们无法突破准确检测混合样本中DNA长度的核心技术障碍，并且成本高昂且操作繁琐。本研究提出了一种新型的纳米级长度敏感传感器，整合了核酸识别和纳米传感技术，使用经典的端粒[28]序列（TTAGGG）作为识别目标[29]。该传感器旨在实现高选择性、高灵敏度和低成本，从而为微量DNA中纳米级长度变化的准确量化提供了一种直接的分析方法，特别是在混合片段样本中。
碳纳米管（CNT）由于其孤立状态下共轭π电子系统的完整性，表现出独特的紫外（UV）吸收峰[30]。它们可以通过独立的光吸收机制实现稳定的光谱响应[31]。然而，当管间距减小到分子间力的有效范围内时，相邻管壁之间的π-π堆叠相互作用会导致电子能级的杂交，从而显著降低UV吸收效率[32]。这种间距与光学性能之间的耦合为构建纳米级距离传感器提供了材料基础[33]。
然而，在CNT的应用中，一个核心挑战是在保持低成本的同时实现高密度官能团接枝和稳定的分散性[34]。目前，最有效的方法是使用高效的分散剂[35]。然而，小分子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDS）、溴化十六烷基三甲基铵（CTAB）和脂肪酸盐[36]、[37]，虽然具有良好的分散能力，但缺乏有效的官能团。相比之下，两亲性聚合物（例如DNA）可以在分散后解决官能团的缺乏问题，同时保持高稳定性[38]、[39]。不幸的是，它们的高成本限制了其在大规模应用中的可行性。
本项目专注于开发具有多反应性官能团、高效分散能力和成本效益的CNT分散材料。PEI[40]是一种具有高密度氨基官能团的聚合物，具有强正电荷特性和长碳链骨架结构，与DNA非常相似。此外，PEI比DNA经济得多，使其成为设计类似DNA的分散剂的理想基质。TRP[41]是一种含有吲哚杂环的化合物，作为功能修饰的单元。其丰富的氨基（-NH2）和羧基（-COOH）官能团可以共价修饰到PEI骨架中，从而形成高密度的表面官能团（图1A）。此外，众多的吲哚环表现出仿生疏水性，有助于与CNT壁的强π-π堆叠相互作用[42]。本研究旨在利用静电吸附和聚合物π共轭的协同机制来实现CNT的有效分散，形成聚合物CNT@PEI-TRP（图1B）。
该策略的机制依赖于CNT间距引起的光学信号差异。为了研究这一点，我们设计了六种不同长度的目标分子：T0′、T0、T4、T9、T12和T15。每个目标分子由两部分组成：5'端和3'端的保守区域以及中间的多个重复TGGAAA序列，长度范围从10到110 nt。目标分子5'端和3'端保守区域的互补序列分别称为P1和P2。随后，P1和P2被固定在CNT@PEI-TRP复合物上，形成复合探针CNT@PEI-TRP@P1和CNT@PEI-TRP@P2。这些复合探针专门设计用于对不同长度的目标产生信号响应。
结果表明，该策略能够准确分析20–110 nt的短链DNA，实现100 ?长度变化的实时监测。它可以直接检测混合DNA的平均长度，无需数据转换，在广泛的浓度范围内以及血清中表现良好。作为一种简单、经济有效的实时DNA长度检测方法，它克服了纳米摩尔级别的限制，具有强大的抗干扰性和稳定性，通过监测单个DNA链的长度成为有效的疾病早期预警工具。
