使用含有泡沫深共晶溶剂（FDES）的泡腾圆盘从提取液中富集微量蛋白质肽

《Separation and Purification Technology》：Enriching trace protein peptides from extract liquid with foaming deep eutectic solvent (FDES)-loaded effervescent discs

利用新型表面活性剂负载泡腾片高效富集蛇蜕蛋白肽，方法结合了泡沫分离技术和深熔盐溶剂的绿色特性，4分钟富集率达91.40%，显著优于传统酒精沉淀法和两相水系统，并通过绿色评估和放大实验验证了实用性。

Xinlu Li|Yong Cao|Jie Tang|Yihan Zhao|Subhan Mahmood|Shun Yao

四川大学化学工程学院，中国成都610065

摘要

蛇蜕皮在营养和功能性应用方面具有巨大潜力，但目前从这种动物原料中可持续高效地提取蛋白质肽的方法相对有限。本文报道了一种新型的泡沫深共晶溶剂（FDES）负载的泡腾圆盘，用于富集蛇蜕皮水解提取物中的目标蛋白质肽。FDES中使用了两种天然甜味剂，这些甜味剂在泡沫稳定方面发挥了重要作用，并提高了FDES的生物相容性。经过全面表征，这些圆盘表现出良好的性能和预期的形成效果。在理想条件下，这些泡腾圆盘在4分钟内富集了91.40%的蛋白质肽，远高于酒精沉淀法（3天内为40.12%）和水相两相系统（1小时内为80.67%）。同时进行了绿色评估和放大实验，以探讨实际应用的可能性。最终，通过全面的物理化学表征验证了富集产品的结构完整性和性能。所开发的方法为从天然产物中获取肽提供了一种快速、可持续的方法。

引言

随着现代科学的进步，对蛇的各种功能性成分的药用潜力的研究受到了广泛关注，并且变得越来越复杂[1]。作为一种未充分利用的副产品，蛇蜕皮已经显示出其作为食品添加剂和保健成分的潜在价值，具有多种治疗作用[2]。蛇蜕皮富含蛋白质和氨基酸，具有抗炎、抗菌、促进伤口愈合和调节免疫等多种生物活性[3]、[4]、[5]、[6]。此外，它还可以提高营养价值和风味，并提供清热、解毒和缓解呼吸系统的健康益处，从而增强了其消费和药用价值[7]。然而，由于提取和分离技术的限制，蛇蜕皮往往未被充分利用。

在利用蛇蜕皮中的活性成分之前，需要对其进行有效制备。因此，该领域已经开展了一些研究。最近在蛇皮蛋白提取方面的进展强调了产量优化、纯度和生物活性的提高，并采用了环境友好的技术。传统的方法如水相/酸碱提取虽然简单，但效率较低且容易导致蛋白质变性[8]，而现代的酶辅助、超声辅助和超临界流体提取方法则具有更高的效率，并能更好地保持蛋白质的完整性。后续的富集步骤包括盐沉淀[9]，然后通过离心和透析去除盐分，有时还会结合色谱和电泳[10]。未来的研究应该探索混合策略、绿色溶剂和创新的分离技术，以进一步提高可扩展性和可持续性[11]，从而进一步发掘蛇蜕皮的应用潜力。

深共晶溶剂（DES）是由氢键供体（HBD）和氢键受体（HBA）按特定比例组成的新型绿色溶剂[12]。DES具有低挥发性、优异的化学稳定性、显著的生物相容性和简单的合成工艺，对蛋白质、活性药物成分和多糖等多种物质具有出色的溶解性[13]、[14]。在蛋白质富集方面，DES已被用于沉淀、水相两相提取和固相提取。例如，氯化胆碱-尿素（1:2）-K₂HPO₄的水相两相系统成功用于富集R-藻红蛋白[15]；Li等人使用四种DES制备了磁性二氧化钛纳米颗粒，并将其应用于胰凝乳蛋白酶的固相提取[16]。总体而言，DES在蛋白质分离领域显示出巨大潜力，但其基本类型、应用形式和技术也需要进一步扩展和创新。在这种背景下，本研究设计了基于天然物质的泡沫DES，并首次将其制备成圆盘形式用于后续应用。

泡沫分离技术，也称为泡沫分级或蛋白质浮选技术，是一种基于表面吸附机制的独特方法[17]。它在多个领域具有广泛的应用潜力，尤其是在高效蛋白质富集方面[18]、[19]。为了进一步提高富集效率，可以通过调节蛋白质浓度、溶液pH值、泡沫层厚度和气泡大小来精确控制工艺参数[20]。例如，Mu等人设计了一种倾斜的泡沫分离柱，用于从红薯淀粉废水中回收蛋白质，表现出优异的富集效率[21]。总之，泡沫分离技术已广泛应用于微量蛋白质的富集，将其与DES和泡腾圆盘结合使用无疑是一个创新的方向。为了从提取液中富集微量蛋白质肽，本研究提出了一种新型的泡沫深共晶溶剂（FDES）负载的泡腾圆盘的设计及其在该领域的应用，这在现有文献中尚未报道，有望为从事蛋白质分离的研究人员提供参考。

试剂和材料

本研究中使用的所有试剂和溶剂均为分析纯（AR）级、药用级或更高等级。除非另有说明，所有实验用水均为超纯（UP）水，由Milli-Q水纯化系统（Millipore，美国贝德福德）提供。无水乙醇、丙二醇、溴化钾、酒石酸、无水碳酸钠、浓盐酸和氢氧化钠由成都科隆化学试剂厂提供。

FDES的泡沫性能

如图1a-1b所示，在振荡前后两种FDES溶液的质量浓度均为10%的情况下，可以观察到斯蒂维醇-甘油水溶液产生的气泡比莫格罗醇-甘油水溶液更多。此外，在光学显微镜下，前者产生的气泡更小且更均匀（见图1c-1d）。如图1e所示，莫格罗醇-甘油在起始点的泡沫率为52.00%

结论

本研究开发了一种新型的泡腾圆盘，该圆盘负载了基于天然甜味剂的FDES，用于高效富集蛇蜕皮水解提取物中的蛋白质肽。FDES负载的泡腾圆盘表现出良好的形态和强烈的起泡行为，显著提高了富集过程的效率。在优化条件下，4分钟内可以实现91.40%的富集率。之后进行了绿色评估和放大实验

作者贡献声明

Xinlu Li：撰写——原始草稿、方法学、实验设计。Yong Cao：可视化处理、软件应用、数据分析。Jie Tang：数据管理、概念构思。Yihan Zhao：验证工作。Subhan Mahmood：撰写——审稿与编辑。Shun Yao：项目监督、资金获取。

资金来源

本文的撰写得到了国家自然科学基金（编号：82273814）和中央高校基本科研业务费/四川大学-泸州科技创新平台建设项目（编号：2022CDLZ-20）的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢四川大学化学工程学院工程实验教学中心的Yanping Huang和Xiang Lin在SEM图像和FT-IR分析方面提供的帮助。