《Toxicon》：Integrating Epidemiological Evidence and Immunodiagnostic Development for Early Diagnosis of
Bothrops spp. Envenomation in Brazil
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巴西巴拉纳州蛇咬伤流行病学调查及新型单克隆抗体诊断工具开发。首次实现蛇种水平鉴定， Bothrops jararaca（占比85.3%）和 jararacussu（占比4.5%）为主要蛇种。通过杂交瘤技术研制出特异性识别 Bothrops 金属蛋白酶的单克隆抗体，建立竞争性ELISA检测体系，灵敏度达60 ng/mL，可区分 Bothrops 与 Crotalus、Lachesis 等相关属蛇毒。研究成果为提升蛇咬伤诊断准确性和流行病学防控提供新工具。
Mariana Fernandes Fonseca|Alessandra Becker-Finco|Bianca Prado-Costa|Guilherme Rabelo Coelho|Michele Marta Weber-Lima|Jo?o Carlos Degraf Muzzi|Isabella Gizzi Jiacomini|Martina Beltramino|Luciana Aparecida Freitas-de-Sousa|Patrícia Bianca Clissa|Juliana Ferreira de Moura|Larissa Magalh?es Alvarenga
巴拉那联邦大学基础病理学系微生物学、寄生虫学和病理学研究生项目，巴西库里蒂巴，邮编81531-980
摘要
蛇咬中毒仍然是巴西的一个重大公共卫生问题，其中Bothrops属的蛇类导致了大多数病例。为了支持公共卫生规划，我们分析了巴拉那州的流行病学数据，并首次报告了该地区导致事故的蛇类的物种鉴定结果。Bothrops jararaca占病例的85%以上，其次是Bothrops jararacussu，这进一步强调了它们的流行病学和临床重要性。基于这些证据，我们利用杂交瘤技术生产了两种单克隆抗体，用于早期识别Bothrops属蛇类的中毒。这些抗体经过测序和免疫化学表征，能够特异性地识别Bothrops属的金属蛋白酶。在竞争性ELISA检测中，该试剂可以在含有B. jararaca和Bothrops alternatus毒液的血清中检测到低至60 ng/mL的毒液浓度，并且对其他具有医学意义的蛇属没有反应。尽管检测B. jararacussu、Bothrops moojeni和Bothrops neuwiedi需要更高的毒液浓度，但这些毒液仍然可以被检测到，表明其具有更广泛的应用潜力。这些发现为Bothrops属蛇类中毒的诊断平台开发提供了新的流行病学和免疫诊断见解。
引言
全球每年报告约有五百万例蛇咬中毒病例，导致大约8万至13.7万人死亡（世界卫生组织，2023年）。在巴西，蛇咬中毒是一个严重问题，每年有3万例病例（巴西卫生部，2025年），主要影响医疗资源有限的农村人口（Bochner和Struchiner，2003年）。超过80%的病例是由Bothrops属的蛇引起的，其余病例则归因于Crotalus、Lachesis和Micrurus属（巴西卫生部，2025年）。在具有医学意义的Bothrops属蛇类中，一些重要物种包括Bothrops jararaca、Bothrops jararacussu、Bothrops moojeni、Bothrops neuwiedi和Bothrops alternatus（世界卫生组织，2017年）。由于这些蛇类的临床和流行病学重要性以及它们毒液的成分（这些成分与其他Bothrops属蛇类的毒液具有保守结构域），这五种蛇被用于生产抗蛇毒血清（Camey等人，2002年；Sousa等人，2013年）。
尽管中毒事件发生率很高，但确定导致咬伤的蛇的物种仍然具有挑战性，因为准确鉴定需要受过培训的人员，而在蛇咬事件最频繁的偏远地区往往缺乏这样的人员（Knudsen等人，2021年；White，2013年）。为了解决这个问题并提供有价值的流行病学数据，巴拉那州卫生部（SESA-PR）实施了由有毒动物引起的事故监测州计划，收集蛇咬事件的照片或样本，以便在动物分类实验室进行分类鉴定。
目前，蛇咬中毒的诊断主要基于临床症状。然而，不同的蛇类（如Bothrops属和Lachesis属）可能引起重叠的临床表现，使得区分它们变得困难，从而影响正确抗蛇毒血清的施用（Knudsen等人，2024年）。为了解决这些问题，一些研究小组开发了针对特定属的诊断测试。然而，大多数这些测试依赖于多克隆抗体的混合物（Barral-netto等人，1990年；Chavez-Olortegui等人，1993年；de Faria等人，2018年；Heneine和Catty，1993年），这影响了测试的可重复性。唯一能够诊断Bothrops属蛇类中毒的单克隆抗体（mAb）未能检测到B. jararacussu的毒液（Knudsen等人，2023年），而B. jararacussu在巴西具有重要的临床和流行病学意义（Milani Junior，1997年）。
在这项研究中，我们整理了SESA-PR提供的流行病学数据，并开发了一种基于单克隆抗体的诊断测试，能够检测巴西最具有临床意义的Bothrops属蛇类的毒液。这有助于更准确地识别导致咬伤的蛇属，从而确保施用适当的抗蛇毒血清。
蛇类鉴定和地理定位程序
蛇类鉴定由动物分类实验室（LabTax）通过动物毒液报告系统（SINAP）进行，作为有毒动物引起的事故监测州计划（PEVAAPV）的一部分，在2010年至2024年间实施。当样本被带到巴西巴拉那州的动物传染病和中毒监测部门（DVVZI）或患者提供照片记录时，就会进行鉴定。
巴拉那州Bothrops属、Crotalus属和Micrurus属蛇咬病例的分布
2010年至2024年间，共收集了1096条与蛇咬事件相关的蛇，并将其送往动物分类实验室进行物种鉴定。在Bothrops属中，共报告了958例病例，鉴定出7个物种。Bothrops jararaca是最常见的致病蛇（n = 817），其次是Bothrops jararacussu（n = 50）、Bothrops diporus和Bothrops moojeni（各n = 25）、Bothrops alternatus和Bothrops neuwiedi（各n = 17）。
讨论
世界卫生组织（WHO）在2019年成立了一个蛇咬中毒工作组，旨在到2030年将蛇咬中毒相关的死亡率和残疾率减半，强调了在诊断、改善治疗途径和加强流行病学监测方面的创新需求（Williams等人，2019年）。本研究的结果符合这一战略的两个支柱：
结论
本研究结合了流行病学分析和基于抗体的创新方法，以推进Bothrops属蛇类中毒的诊断。我们开发了一种竞争性ELISA方法，能够检测巴西南部最具有流行病学意义的Bothrops属蛇类的毒液。该检测方法能够检测到与B. jararaca和B. alternatus引起的人类中毒相匹配的毒液浓度，且不对其他具有临床意义的蛇属产生交叉反应。通过进一步优化，其
CRediT作者贡献声明
Guilherme Coelho：方法学、研究、概念设计。Jo?o Muzzi：写作——审稿与编辑、可视化、数据分析。Michele Marta Weber-Lima：写作——审稿与编辑、方法学、数据分析。Isabella Jiacomini：写作——审稿与编辑、方法学。Martina Beltramino：写作——审稿与编辑、方法学。Patrícia Clissa：写作——审稿与编辑、方法学、研究。Luciana de-Sousa：写作——审稿与编辑、方法学。
未引用参考文献
Costa和Bérnils，2018年；Tabatabaei等人。
利益冲突
作者声明没有利益冲突。
伦理声明
本研究未涉及人类参与者或动物。仅使用了商业化的试剂和体外实验程序，因此不需要伦理批准。
资助
本研究得到了巴西CAPES（高等教育人员培训协调机构）——资助代码001、巴西CNPQ（国家科学技术发展委员会）——资助编号307437/2025-6以及INCT INOVATOX（国家毒素研究科学技术研究所）的资助。JCDM得到了BIG DATA创新计划的支持，该计划由Behring基金会资助。质谱分析得到了相关资助。利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或可能影响本文工作的个人关系。
致谢
作者感谢Ana Marisa Chudzinski-Tavassi博士提供了质谱分析所需的基础设施、试剂和设备。我们还要感谢她的员工Hugo Vigerelli在分析和解释结果方面提供的帮助。此外，MFF还要感谢巴拉那州卫生部的Juliana Cequinel分享了流行病学数据。
