《TrAC Trends in Analytical Chemistry》：Re-engineering Detection Paradigms: Atypical Reporters in CRISPR/Cas12a-Based Biosensing
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CRISPR/Cas12a系统的新型报告器研究进展，涵盖工程线性DNA、特殊构象DNA、DNA-粒子共轭及DNA水凝胶等类型，分析其设计原理、工作机制及优势特性，如超低检测限、抗干扰能力提升、免标记信号转换和多场景应用适配等，并探讨现存挑战与未来发展方向。
刘聪|黄玉杰|刘子龙|黄楚秀
华中科技大学法医学系，中国湖北省武汉市香港路13号，430030
摘要
CRISPR/Cas12a系统已成为一种强大且前景广阔的生物传感平台，在该平台上，报告分子在决定检测性能方面起着关键作用。虽然传统的荧光团-淬灭剂标记的单链DNA（ssDNA）报告分子简单且被广泛采用，但它存在固有的局限性，包括灵敏度不足、对基质干扰的敏感性高以及信号输出方式有限。近年来，人们精心设计了多种非传统的报告分子，显著提高了基于Cas12a的生物传感器的性能。本综述系统地总结了这些创新报告分子的最新进展，涵盖了工程化线性DNA报告分子、特殊构型DNA报告分子、DNA-颗粒结合报告分子和DNA水凝胶报告分子。文章详细阐述了它们的设计原理、工作机制以及出色的性能特点，如超低检测限、增强的抗干扰能力、无标记信号转导能力以及与即时检测的兼容性。最后，本文进一步讨论了关键挑战和未来的发展方向，为下一代报告分子的开发提供了宝贵的参考。
引言
成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）和CRISPR相关蛋白12a（Cas12a）系统已成为生物传感领域的变革性工具。该系统的核心组成部分包括四种关键元素：Cas12a核酸酶、CRISPR RNA（crRNA）、目标核酸和报告分子（图1）。crRNA作为分子引导剂，指导Cas12a特异性识别并切割互补的目标核酸。成功切割后，Cas12a酶发生构象变化，激活其非特异性切割活性，从而能够无差别地降解单链DNA（ssDNA）。这一独特特性为基于Cas12a的检测平台的发展奠定了基础。研究人员设计了两端修饰有荧光团（F）和淬灭剂（Q）的ssDNA作为“报告”分子。激活的Cas12a的切割行为使荧光团与淬灭剂分离，从而恢复可检测的荧光。最初使用的经典ssDNA报告分子为F-TTATT-Q，是这种设计的先驱示例[1]。
作为基于Cas12a的生物传感器中信号转导的关键环节，报告分子的性能直接决定了传感器的灵敏度、特异性及其在现实场景中的适应性。由于信号转换的简便性，经典的F-Q标记ssDNA报告分子被广泛采用。然而，在实际应用中，尤其是在复杂基质或资源受限的环境中，这种传统报告分子的固有局限性变得越来越明显。这些缺点包括对未扩增样本的灵敏度不足、对基质干扰的敏感性高、依赖昂贵的荧光标记以及信号输出方式有限[2]、[3]。为了解决这些问题，人们开发了多种非传统的报告分子，大大扩展了基于Cas12a的生物传感器的应用范围。这些创新报告分子包括工程化线性DNA[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]、特殊构型DNA[10]、[11]、[12]、DNA-颗粒结合结构[13]、[14]、[15]和DNA水凝胶[16]。这些非传统报告分子在特定方面表现出优异的性能，如超高灵敏度、抗基质干扰能力、多重检测能力或与即时检测设置的兼容性。
目前，关于CRISPR/Cas组分的工程化研究，如Cas蛋白、crRNA和反应缓冲液配方的系统综述已经发表[17]、[18]。然而，作为关键系统的组成部分，报告分子很少受到专门的研究。2022年，M. Sohail等人对报告分子的传感原理和应用进行了启发性的讨论[19]，但该研究并未对报告分子进行基于结构特征的详细分类和分析。最近有一篇文章总结了一类用于增强CRISPR/Cas诊断的报告分子（高阶核酸探针），但许多其他新兴且关键的报告分子类型，如双链DNA（dsDNA）报告分子、DNA-颗粒结合报告分子、水凝胶报告分子等尚未被纳入[2]。因此，目前仍缺乏对这些非传统报告分子的设计原理、工作机制、性能权衡和应用范围的全面和最新的整合。这一空白阻碍了对Cas12a报告分子进化路径的全面理解以及下一代生物传感器的合理设计。因此，本综述重点总结了基于Cas12a的生物传感中的这些非传统报告分子，根据它们的结构和功能特性进行分类，详细阐述了它们的设计策略和性能优势，讨论了未解决的挑战，并概述了未来的发展方向。本文旨在为Cas12a报告分子的创新和基于CRISPR的生物传感平台的临床转化提供理论框架和技术参考。
部分摘录
ssDNA报告分子
经典的F-TTATT-Q报告分子在基于Cas12a的检测方法开发中被广泛直接采用。然而，越来越多的证据表明，ssDNA报告分子的核苷酸序列、长度和修饰类型对Cas12a系统的检测效率有显著影响（图2）。一项系统研究评估了具有不同序列组成（GC富集型 vs. TA富集型）和荧光标记（FAM、HEX和Cy5）的5核苷酸报告分子
特殊构型DNA报告分子
为了克服经典ssDNA报告分子的固有局限性，研究人员创新设计了多种具有特殊构型的报告分子。如图4所示，这些结构包括发夹结构、G四链体（G4）、G三链体（G3）、四面体DNA框架（TDF）和环状DNA结构。以下部分将详细阐述它们的设计理由和性能优势，这些内容也在补充信息中的表S2中进行了总结。
DNA-颗粒结合报告分子
微纳米颗粒（M/NPs）凭借其独特的物理和化学性质，成为响应Cas12a系统的强大工具。本节探讨了M/NPs与Cas12a报告分子结合的各种方式，以及这些结合对系统分析性能的影响。值得注意的是，基于CRISPR/Cas12的电化学检测平台已在现有文献中得到全面综述[43]、[44]。因此，本节DNA水凝胶报告分子
将水凝胶报告分子整合到CRISPR/Cas12a系统中可以利用其独特性质，解决传统检测方法中的关键问题。水凝胶报告分子具有显著优势，包括可通过Cas12a切割活性触发可编程的降解，从而实现信号释放和放大的时空控制[16]。水凝胶的三维网络结构为封装各种信号分子提供了坚固的平台挑战与展望
尽管在开发基于Cas12a的生物传感的非传统报告分子方面取得了显著进展，但仍需解决几个关键挑战，以充分发挥它们在临床、环境、食品和法医应用中的潜力。本节强调了主要瓶颈，并提出了克服这些限制的有希望的策略。
CRediT作者贡献声明
刘聪：撰写——综述与编辑、撰写——初稿、验证、概念化。黄玉杰：撰写——综述与编辑。黄楚秀：撰写——综述与编辑、研究、资金获取。刘子龙：撰写——综述与编辑
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（资助编号：22576075）、湖北省自然科学基金（资助编号：2023AFB1088）、湖北省司法鉴定产业研究项目（资助编号：06）、湖北警察学院的法医学重点实验室（资助编号：KFKT2023003）以及中国政法大学的证据科学重点实验室开放项目的支持
