RING1A/B错义突变通过破坏Polycomb复合物平衡导致神经发育障碍的机制研究

《Molecular Cell》：Unbalanced chromatin binding of Polycomb complexes drives neurodevelopmental disorders

本研究针对RING1A和RNF2基因错义突变导致神经发育障碍（NDDs）的分子机制展开深入探索。研究人员通过构建Rnf2R70H基因敲入小鼠模型，结合多组学分析发现，RING1BR70H突变体通过改变与PCGF蛋白的相互作用特异性，破坏PRC1亚复合物的染色质招募平衡，导致H2AK119ub水平异常和神经分化缺陷。该研究首次揭示了Polycomb复合物亚型平衡失调在神经发育中的关键作用，为相关疾病的诊疗提供了新靶点。

　　

在人类发育过程中，精确的基因表达调控至关重要，而表观遗传调控机制特别是Polycomb群（PcG）蛋白在这一过程中发挥着关键作用。Polycomb抑制复合物PRC1和PRC2通过催化组蛋白H2A第119位赖氨酸单泛素化（H2AK119ub）和组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化（H3K27me3），沉默发育相关基因的表达。近年来，越来越多研究发现PcG基因的突变与神经发育障碍（NDDs）密切相关，患者常表现为智力障碍、自闭症谱系障碍和发育迟缓等症状。

尽管已有研究表明RING1A和RING1B（PRC1的核心催化亚基）的突变会导致NDDs，但这些突变如何影响Polycomb复合物的功能并最终导致神经发育异常的分子机制尚不清楚。特别是错义突变（单个氨基酸替换）对PRC1复合物组装、催化活性以及靶基因沉默的具体影响机制仍有待阐明。

为了解决这一科学问题，研究团队在《Molecular Cell》上发表了最新研究成果，系统阐述了RING1A/B错义突变通过破坏Polycomb复合物平衡导致神经发育障碍的分子机制。研究人员通过整合临床数据分析、基因编辑小鼠模型和多组学技术，揭示了RING1B^R70H突变体如何特异性地改变PRC1亚复合物的染色质结合特性，进而影响神经分化和脑发育的关键过程。

研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：从临床数据库（ClinVar、gnomAD、OMIM等）中鉴定RING1A和RNF2的致病性错义突变；利用CRISPR-Cas9技术构建Rnf2^R70H基因敲入小鼠模型和细胞系；通过蛋白质质谱分析突变体与PRC1各亚基的相互作用变化；运用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）、转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）和单细胞多组学测序（10x Multiome）等技术在全基因组水平评估染色质状态和基因表达变化；采用免疫荧光、Western blotting等分子生物学方法验证关键发现；通过磁共振成像（MRI）束路成像和行为学测试评估突变小鼠的脑结构连接和认知功能变化。

^RING1和^RNF2突变揭示与神经病理相关的离散PRC1扰动

研究人员首先从多个临床数据库中共鉴定出15个RING1A/B的错义突变位点，其中RING1B^R70H突变具有较高的致病性预测评分。蛋白质结构预测分析表明，R70H突变位于RING1B与PCGF蛋白相互作用的关键界面，可能影响PRC1复合物的稳定性。功能实验证实，RING1B^R70H突变体虽然能正常表达，但其催化活性显著降低，导致H2AK119ub水平下降。更重要的是，该突变改变了RING1B与不同PCGF亚基的结合偏好，增强了与PCGF2（cPRC1.2复合物）的相互作用，而减弱了与PCGF1/3/5/6（vPRC1复合物）的结合。

Ring1b^R70H破坏Polycomb复合物共占据平衡，导致基因上调突变cPRC1.2在染色质上积累

为了在更生理相关的模型中研究RING1B^R70H突变的影响，研究人员通过同源重组技术构建了Rnf2^WT/R70H小鼠胚胎干细胞（ESCs）。研究发现，尽管突变细胞中Ring1b蛋白表达正常，但H2AK119ub和H3K27me3水平均显著降低。转录组分析显示，与神经发育和体轴模式特异性相关的PcG靶基因被异常激活。等位基因特异性染色质分析进一步揭示，Ring1b^R70H突变体在染色质上的招募增强，且优先与cPRC1.2复合物结合，导致vPRC1复合物从染色质上解离，破坏了正常的PRC1/2复合物平衡。

Ring1b^R70H通过PRC1.2偏向神经谱系选择，抑制神经发生

研究人员将WT和Rnf2^WT/R70HESCs分化为神经前体细胞（NPCs）并进行单细胞RNA测序分析。结果显示，突变型NPCs中与轴突导向和神经元发育相关的基因表达显著下调，而与神经胶质细胞和炎症相关的基因表达上调。免疫荧光染色证实，Rnf2^WT/R70HNPCs的神经元分化能力受损，而胶质细胞分化增强。机制上，Ring1b^R70H通过破坏PRC1复合物平衡，异常抑制Wnt信号通路活性，从而阻碍神经元分化进程。

异常Polycomb占据重塑NPCs中的染色质可及性景观，促进胶质分化

通过单细胞ATAC-seq分析，研究人员发现Rnf2^WT/R70HNPCs在全基因组范围内出现染色质过度压缩现象。特别值得注意的是，与神经元分化和功能相关的关键基因（如Pax6、Sox2/3、Wnt通路基因）所在区域的染色质可及性显著降低。进一步分析显示，这种染色质状态的改变与转录因子结合位点的可及性变化相关，其中Sox2/3结合位点可及性降低，而AP-1家族转录因子结合位点可及性增加，这可能是导致神经元/胶质细胞分化平衡失调的重要原因。

纯合Rnf2^R70H小鼠围产期致死，杂合小鼠显示与NDDs相关的脑结构缺陷

在体水平，研究人员发现纯合Rnf2^R70H/R70H小鼠出现围产期致死，而杂合Rnf2^WT/R70H小鼠虽然可存活，但表现为生长迟缓和脑体积减小。MRI束路成像分析显示，突变小鼠前额叶皮层（mPFC）和海马的神经元轴突连接模式发生显著改变，其中mPFC向其他脑区的投射增强，而基底外侧杏仁核的投射减少。海马CA3与齿状回（DG）之间的连接异常增加，这可能与焦虑样行为相关。

Ring1b^R70H异常压缩染色质并改变海马和mPFC的发育轨迹

单细胞多组学分析进一步揭示了Rnf2^WT/R70H小鼠脑细胞的发育轨迹异常。在海马和mPFC中，突变导致兴奋性神经元分化受阻，而胶质细胞谱系过度扩增。具体而言，海马颗粒细胞的成熟延迟，而星形胶质细胞和小胶质细胞比例增加。在mPFC中，深层皮质丘脑（CT）和端脑外（ET）神经元减少，这些变化可能与认知和情绪处理缺陷相关。

Rnf2^WT/R70H小鼠社交新颖性偏好受损和焦虑样行为增加

行为学测试结果表明，Rnf2^WT/R70H小鼠在社交性测试中表现出对陌生小鼠的偏好性降低，社交新颖性识别能力受损。旷场实验显示突变小鼠的焦虑样行为增加，而空间学习和恐惧条件记忆测试未发现显著差异。这些行为表型与观察到的脑结构连接异常和细胞组成变化相一致，为理解Polycomb相关神经发育障碍的临床表现提供了重要线索。

研究结论与意义

本研究系统阐明了RING1A/B错义突变导致神经发育障碍的分子机制。研究发现，RING1B^R70H突变通过改变与不同PCGF蛋白的相互作用特异性，破坏PRC1亚复合物的平衡，导致染色质状态异常和基因表达紊乱。在发育过程中，这种失衡特别影响神经分化进程，导致神经元/胶质细胞比例失调和脑连接异常，最终引发认知和行为缺陷。

该研究的创新性在于首次揭示了Polycomb复合物亚型平衡在神经发育中的关键作用，提出了"Polycomb亚型失衡"导致神经发育障碍的新机制。这不仅深化了对Polycomb蛋白功能的理解，也为相关疾病的诊断和治疗提供了新的靶点和思路。未来针对特定PRC1亚复合物的调控可能成为治疗Polycomb相关神经发育障碍的新策略。

此外，研究建立的Rnf2^R70H小鼠模型为深入研究相关疾病的病理机制和筛选治疗药物提供了有价值的平台。多组学分析方法的综合应用也为解析复杂表观遗传调控网络的功能提供了范例，有助于推动表观遗传学与神经发育领域的交叉研究发展。