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本研究揭示了细菌免疫系统AVAST type 5（Avs5）通过识别巨型噬菌体早期蛋白JADA（Jumbo phage Avs5 Defense Activator），激活其Sir2结构域介导的NAD+水解，从而阻断噬菌体核形成并终止感染。该发现阐明了Avs5系统对抗具有核样结构的巨型噬菌体的分子机制，为理解原核生物免疫策略提供了新视角。
在微生物世界的军备竞赛中，细菌与噬菌体（即感染细菌的病毒）之间的攻防战从未停歇。近年来，科学家们发现了一类特殊的“巨型噬菌体”（jumbo phages），它们属于Chimalliviridae家族，拥有庞大的基因组（通常超过200 kb）。这类噬菌体在感染过程中会采取一种极其巧妙的策略：它们在宿主细菌细胞内构建一个类似细胞核的“噬菌体核”（phage nucleus），将自己的遗传物质包裹其中。这个由蛋白质外壳形成的核状结构能够有效屏蔽细菌多种DNA靶向的免疫系统（如CRISPR-Cas系统和限制性内切酶系统）的攻击，使得噬菌体能够安全地进行基因复制和转录。面对这种“金钟罩”般的防御，细菌必然演化出相应的反击手段。然而，能够特异性对抗这些“核形成”巨型噬菌体的细菌防御系统，此前人们知之甚少。
本研究聚焦于一类名为AVAST（Antiviral ATPases of the STAND Superfamily，STAND超家族抗病毒ATP酶）的细菌防御系统，特别是其中的第5型（Avs5）。Avs5属于古老的信号转导ATP酶（STAND）NTP酶超家族，该家族蛋白在从细菌到动植物的天然免疫中均扮演着关键角色。它们通常具有模块化的结构：一个中心的NTP酶结构域用于感知能量状态变化，一个C端的传感器结构域用于识别病原体相关分子模式（PAMP），以及一个N端的效应器结构域负责执行防御功能。Avs5的效应器是一个Sir2样结构域，已知具有水解重要辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的活性。尽管Avs5系统在多种细菌中被发现，且已知能提供对巨型噬菌体的免疫，但其被噬菌体感染激活的具体分子机制、其作用的时空动态以及其如何特异性识别并阻断巨型噬菌体感染，一直是未解之谜。
为了回答这些问题，研究人员在Pseudomonas aeruginosaPAO1菌株中展开了对PaAvs5系统的深入研究。研究发现，来自不同进化支（clade）的PaAvs5同源蛋白均能有效抵御核形成巨型噬菌体Pa36的感染。通过系统的功能缺失突变分析，研究人员证实了PaAvs5的Sir2样结构域的NAD+水解活性及其ATP酶结构域的核苷酸结合能力对于其免疫功能至关重要。感染后，细胞内的NAD+水平迅速下降，而其水解产物ADPR（腺苷二磷酸核糖）水平则相应上升，表明PaAvs5在感知感染后被激活。
那么，是什么“钥匙”开启了PaAvs5这把“防御锁”呢？利用TurboID邻近标记技术（一种在活细胞内标记相互作用蛋白的技术），研究人员在感染早期筛选并鉴定出一个名为JADA（Jumbo phage Avs5 Defense Activator）的噬菌体蛋白是PaAvs5的关键激活因子。JADA是噬菌体Pa36的一个早期表达且对其复制至关重要的蛋白。进一步的实验证实，单独在细菌中表达JADA就足以激活PaAvs5系统，导致细菌生长抑制，而这种激活作用依赖于PaAvs5的功能完整性。
通过冷冻电镜（cryo-EM）技术，研究人员解析了JADA蛋白的高分辨率结构（2.1 ?），揭示其以一种新颖的同源二聚体形式存在。虽然其结构与已知蛋白无显著同源性，但其表面电荷分布提示其可能具有DNA结合或调控功能。荧光显微镜观察显示，在噬菌体感染早期，PaAvs5蛋白会聚集并定位到被称为“早期噬菌体感染囊泡”（EPI vesicle）的结构附近，而JADA蛋白也显示出相似的定位模式。这种共定位表明，PaAvs5在感染位点“守株待兔”，一旦检测到JADA的出现，便迅速启动免疫应答。
激活的PaAvs5通过其Sir2结构域快速水解细胞内的NAD+。NAD+是细胞能量代谢和众多生物合成反应的核心辅酶，其急剧耗竭很可能破坏了细胞的能量状态和代谢平衡，从而打断了噬菌体复制所必需的生物合成过程，特别是阻止了功能性噬菌体核的形成。尽管在感染后期NAD+水平可能因噬菌体或宿主的补救合成途径而有所恢复，但早期的NAD+“闪电战”已足以有效中止感染进程，保护细菌群体。
本研究综合运用了分子克隆、蛋白质生化分析、荧光显微成像、TurboID邻近标记蛋白质组学、冷冻电镜结构解析、噬菌体斑块试验（efficiency of plaquing）、一步生长曲线（one-step growth curve）以及液相色谱-质谱（LC-MS）代谢物定量等技术。研究中使用的细菌菌株和噬菌体来源于标准保藏中心（如Fagenbank）和临床分离株。
Shared anti-jumbo phage immunity by Avs5 homologs across phylogenetic clades
研究人员首先构建了Avs5的系统发育树，将其分为四个主要支系。他们选取了P. aeruginosa中的三个代表性Avs5同源物（PaAvs5-1, PaAvs5-2, PaAvs5-3）进行功能测试。结果表明，尽管这些同源物对其它类型噬菌体的免疫力存在差异，但它们都对核形成巨型噬菌体Pa36和ΦKZ表现出强烈且保守的抑制作用，显著降低了噬菌体的成斑效率。
Structural and sequence variability in Avs5-sensing domains potentially drive immunity differences
通过对PaAvs5结构域的生化与生物信息学分析，研究人员确认其包含N端的Sir2效应结构域、中心的STAND NTP酶结构域和C端的可能用于识别的重复序列结构域。点突变实验证明，Sir2结构域的催化残基（如Asn110）和ATP酶结构域的Walker A motif（如Lys363）对于PaAvs5的免疫功能不可或缺。
PaAvs5 inhibits formation of jumbo phage nucleus, and it migrates to the phage infection site
利用荧光标记的PaAvs5蛋白进行活细胞成像，研究人员观察到在噬菌体感染后，PaAvs5会从胞质中弥散分布转变为在细菌极区或膜附近形成明显的 foci（聚集点）。这些foci与标记噬菌体DNA的DAPI信号点以及标记膜结构的MitoTracker信号有共定位，表明PaAvs5被招募到了早期感染部位（EPI囊泡）。在表达有功能PaAvs5的细胞中，噬菌体核的形成被显著抑制，而对照细胞或表达失活突变体的细胞中则能观察到完整的噬菌体核。
Sir2 domain of PaAvs5 initiates NAD+hydrolysis upon activation
通过LC-MS精确测量感染过程中细胞内NAD+和ADPR的浓度变化，研究人员发现，在表达有功能PaAvs5的细胞感染Pa36后10分钟内，NAD+水平急剧下降约70%，同时ADPR水平上升超过50%。这一快速的代谢变化在表达催化失活突变体（N110A）的细胞中并未出现，直接证明了PaAvs5的Sir2结构域在感染早期被激活并水解NAD+。
Identification of PaAvs5 activator via TurboID proximity labeling
为了寻找激活PaAvs5的噬菌体因子，研究人员将邻近标记酶TurboID与PaAvs5融合，在感染条件下对PaAvs5周围的蛋白质进行生物素标记和质谱鉴定。从鉴定到的噬菌体蛋白中，他们发现gp316（即JADA）在所有生物学重复中均被显著富集。后续的遗传学实验证实，表达JADA足以激活PaAvs5系统，导致细菌死亡，而JADA的C端结构域是激活所必需且足够的区域。
JADA is an early activator of PaAvs5
生物信息学分析显示，JADA基因在多种核形成巨型噬菌体基因组中保守存在，且其基因组位置通常紧邻一个非 virion RNA聚合酶（nvRNAP）亚基基因，暗示其可能是一个早期表达的、功能重要的噬菌体蛋白。细菌双杂交（Bacterial two-hybrid, BACTH）和体外pull-down实验进一步证实了JADA与PaAvs5之间存在直接的物理相互作用。
讨论与意义
本研究深入揭示了Avs5这一重要的细菌防御系统对抗核形成巨型噬菌体的精细分子机制。其核心在于：细菌利用Avs5蛋白作为“哨兵”，定位至噬菌体感染的起始部位，通过直接识别噬菌体早期表达的、必需的“模式”蛋白JADA，从而精准地激活其NAD+水解活性。这种快速的代谢干扰策略，在噬菌体建立其“保护核”之前就有效地扼杀了感染，体现了一种高效且特异的“先发制人”免疫策略。
该研究的发现具有多重重要意义：首先，它阐明了一种新型的细菌免疫机制，即通过感知特定的病毒蛋白而非核酸来触发防御反应，扩展了我们对原核生物免疫系统多样性的认识。其次，研究揭示了NAD+代谢在细菌-噬菌体相互作用中的核心地位，为理解免疫信号转导和代谢免疫（immunometabolism）提供了新视角。此外，JADA作为一个保守的噬菌体蛋白被识别为Avs5的激活因子，提示针对此相互作用界面可能开发出新型的抗菌或抗噬菌体策略。最后，Avs5与真核生物中NOD样受体（NLR）在结构和功能上的相似性，暗示了先天免疫机制在生命树不同分支间可能存在深远的进化联系。
总之，这项发表于《Molecular Cell》的研究工作，不仅解答了Avs5系统如何特异性防御巨型噬菌体这一具体科学问题，更重要的是，它为我们理解微生物世界中复杂而精妙的宿主-病原体相互作用提供了新的范例和深刻见解。
