《Cell Genomics》：Nematode extracellular protein interactome expands connections between signaling pathways
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本研究针对胞外蛋白互作研究匮乏的难题，系统构建了秀丽隐杆线虫（C. elegans）胞外结构域文库，通过高通量胞外互作检测技术（ECIA）绘制了包含374种蛋白的互作网络。研究发现159个全新蛋白互作，揭示了轴突导向通路间的直接联系，并鉴定出ZIG蛋白家族作为胰岛素信号的高亲和力配体，其过表达可延长线虫寿命。该数据集为解析神经元连接、细胞间通讯及衰老相关信号通路提供了重要资源。
在生命科学领域，细胞表面的受体蛋白和分泌的配体蛋白犹如细胞的"触角"和"信号弹"，它们通过相互作用构建细胞间连接、介导信息传递，并感知外界环境变化。这些蛋白对多细胞生命至关重要，且由于它们位于细胞表面或细胞外，更容易成为药物靶点。然而，由于技术限制，大部分胞外蛋白组的结合伴侣仍属未知，这严重阻碍了我们对这些蛋白功能角色的理解，成为揭示其生物学机制的道路上的拦路石。
近年来，基因组测序数据的爆发和生物信息学工具的进步，为研究细胞表面和分泌蛋白的相互作用打开了大门。科学家们开发了一些专门的高通量方法来探测这些胞外相互作用，并在突触靶向、神经元排斥、植物免疫信号网络等多个领域取得了重要发现。尽管如此，现有的胞外互作组研究仍存在明显局限：它们通常只关注少数几个蛋白家族（如免疫球蛋白超家族IG、富含亮氨酸重复序列LRR的蛋白等），而胞外蛋白折叠空间的绝大部分仍未被探索；通量仍需提升以扩展数据集；此外，这些方法在重要模式生物中的应用仍然有限。
为了解决这些挑战，并深入理解胞外相互作用在发育、生理和疾病中的作用，由Engin ?zkan领导的研究团队将目光投向了经典模式生物——秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）。线虫因其细胞接触明确且模式固定，是研究细胞表面蛋白互作组的理想模型。其基因组中细胞表面蛋白家族的旁系同源物通常比人类少，这使得研究人员能够更全面地覆盖与人类生理相关的受体和配体家族。研究人员在《Cell Genomics》上发表了他们的最新成果，报道了一个全面的线虫胞外互作组数据集，揭示了信号通路之间许多意想不到的连接。
为开展本研究，研究人员主要应用了以下几项关键技术：首先，构建了包含379个线虫胞外结构域（涉及374个基因）的表达文库，覆盖了12个结构域家族的全部成员以及74个结构域家族的部分成员。其次，建立并优化了基于亲和力增强原理的高通量胞外互作检测技术（Extracellular Interactome Assay, ECIA），利用Fc标签的胞外结构域作为"诱饵"（bait），碱性磷酸酶（AP）标签的五聚化胞外结构域作为"猎物"（prey），显著提高了检测灵敏度。第三，开发了基于最大熵网络集成（Maximum Entropy network ensemble-based technique）的新型统计模型来分析ECIA数据，以更严谨地识别显著的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）。此外，研究还结合了表面等离子共振（SPR）验证关键互作的亲和力，利用X射线晶体学解析了ZIG-4与INS-6复合物的三维结构，并通过AlphaFold-Multimer进行了大规模的蛋白质复合物结构预测。功能验证方面，在活体线虫中进行了基因过表达实验，观察其对发育（dauer形成）和寿命的影响。
研究结果
构建线虫胞外结构域文库及互作网络
研究人员成功构建了一个包含379个独特胞外结构域变体的文库，这些结构域来源于374个细胞表面受体和分泌蛋白基因，涵盖了约86种不同类型的结构域或折叠，包括免疫球蛋白（IG）、纤连蛋白III型（FN）、富含亮氨酸重复序列（LRR）、钙粘蛋白（Cad）、表皮生长因子（EGF）等。通过优化的ECIA流程，研究人员测试了约72,010对可能的相互作用。利用新开发的统计方法，在中等置信度水平下报告了185个相互作用，其中159个（86%）是此前未知或无法通过已知复合物同源性预测的。这些相互作用构成了一个复杂的胞外互作网络。
互作网络的群落结构分析
对ECIA互作网络进行群落结构分析发现，蛋白质倾向于根据已知功能进行分组。例如，已知介导轴突导向的蛋白质，如Robo、Slit、ephrin、Eph以及部分semaphorin和plexin，被归入同一群落。这种群落结构反映了蛋白质之间潜在的功能关联，即使它们本身并不直接相互作用。
轴突导向通路间的高阶复合物
研究的一个突出发现是揭示了四大经典轴突导向系统（Slit/Robo、ephrin/Eph、semaphorin/plexin、netrin/UNC-40(DCC) & UNC-5）中三个系统之间存在此前未知的胞外相互作用。例如，SAX-3/Robo不仅与其经典配体SLT-1相互作用，还与ephrin EFN-4以及plexin PLX-1相互作用。同时，EFN-4也与semaphorin MAB-20相互作用，在胞外空间将ephrin受体与plexin配体物理连接起来。通过结构域水平的ECIA实验和尺寸排阻色谱（SEC）验证，研究人员确定了这些相互作用的关键结构域。这些发现表明，可能存在能够整合来自不同通路信号线索的"超信号复合物"（supra-signaling complexes），为理解轴突导向的精细调控提供了新视角。
线虫中一类分泌型胰岛素结合蛋白的发现
研究团队发现，一个名为ZIG（Zwei-IG）的蛋白家族中的四个成员（ZIG-2, -3, -4, -5）是胰岛素样肽（ILPs）的高亲和力结合蛋白。这些ZIG蛋白是分泌蛋白，与已知的跨膜或GPI锚定的ZIGs不同。表面等离子共振（SPR）实验显示，ZIG-4与INS-6的解离常数（KD）达到皮摩尔级别（56 pM），ZIG-5与INS-1的KD为3 nM，表明结合非常紧密。研究人员解析了ZIG-4与INS-6的晶体结构，揭示了其结合界面由一个疏水核心和周围的极性相互作用构成。结构比较和突变分析表明，ZIG-INS复合物的整体结构是保守的。重要的是，通过结构模拟发现，ZIG-4与胰岛素结合后会阻碍形成T形的活性胰岛素受体二聚体（IR2-胰岛素4）复合物，提示ZIGs可能通过隔离胰岛素而拮抗胰岛素信号通路。体内功能实验证实，在蠕虫中过表达zig-4会诱导在食物充足条件下形成dauer幼虫（胰岛素信号抑制的表型），并显著延长成虫寿命，这与抑制胰岛素受体DAF-2的功能一致。这表明ZIG-4是DAF-2/IR的拮抗剂。
胱氨酸结蛋白、推定神经营养因子、生长因子及其受体
研究还鉴定了几类具有生长因子样折叠的分泌蛋白的结合伴侣。例如，两个相关的分泌型胱氨酸结家族蛋白ZK856.6和B0416.2被鉴定为TRK-1（线虫中脊椎动物高亲和力神经营养因子受体Trk家族的直系同源物）的配体，这可能将神经营养素和生长因子的研究扩展到线虫。此外，研究发现线虫的神经元源性神经营养因子同源物NDNF-1与成纤维细胞生长因子受体（FGFR）同源物EGL-15相互作用，这一发现可能解释了为何人类中NDNF和FGFR1基因突变都与先天性低促性腺激素性性腺功能减退症和Kallmann综合征相关。
线虫Wirins蛋白ZIG-8和RIG-5及其相互作用
研究确认了线虫中Dpr和DIP同源物ZIG-8和RIG-5之间的相互作用，这与之前在果蝇中的发现一致。此外，还发现了RIG-5/DIP与一些在神经元和突触功能中已知的蛋白（如受体蛋白酪氨酸磷酸酶PTP-3/LAR、接触蛋白相关蛋白同源物NLR-1/CNTNAP、经典钙粘蛋白HMR-1/CadN）存在相互作用。AlphaFold-Multimer预测和点突变验证表明，RIG-5利用其第二个IG结构域与这些信号受体结合。这些相互作用暗示Dpr/DIP可能通过这些跨膜蛋白传递信号，为理解这类神经连接受体如何调控突触特异性提供了新线索。
AlphaFold对胞外蛋白复合物的预测
研究人员系统性地计算了72个高置信度相互作用和46个随机配对蛋白的AlphaFold-Multimer模型。结果显示，实验检测到的复合物其界面预测模板建模得分（ipTM）平均值（0.495 ± 0.241）显著高于随机配对（0.273 ± 0.139），表明AlphaFold在预测蛋白质复合物形成方面具有实用性，可作为识别未知相互作用的有效工具。
与化学突触对应的相互作用
通过整合线虫神经元连接组（connectome）和基因表达数据，研究人员分析了实验发现的PPIs在支持已知化学突触连接方面的潜在作用。在134个有可用表达数据的PPIs中，绝大多数（130个）能够支持部分已知的化学突触连接。一些相互作用（如TMEM-132-NRX-1, CASY-1-T19D12.6）在突触连接组中非常普遍，而另一些（如SLT-1N-SLT-1C, ZIG-4-DAF-28）的出现则具有高度统计学显著性，提示它们可能具有重要的生物学功能。
研究结论与意义
本研究通过构建大规模、多样化的线虫胞外蛋白互作组资源，极大地拓展了我们对胞外相互作用网络的认识。绝大多数发现的相互作用是全新的，突出了直接实验筛选在发现新生物学机制中的不可替代性。
研究的核心意义在于：首先，揭示了轴突导向通路之间存在直接的胞外相互作用，形成了可能的"超信号复合物"，这为解释这些通路在发育过程中如何协同工作以精确引导轴突生长提供了新的分子基础。其次，发现ZIG蛋白家族作为一类分泌型胰岛素结合蛋白，能够以高亲和力结合特定胰岛素样肽并拮抗胰岛素受体信号，从而调控线虫的发育转换和寿命。这不仅为解决线虫中大量ILPs如何被精细调控的难题提供了机制，也提示无脊椎动物中可能存在不同于脊椎动物IGFBP（胰岛素样生长因子结合蛋白）的胰岛素信号调控方式。此外，对生长因子样分子（如推定神经营养因子、NDNF）相互作用的发现，有望将相关生物学过程的研究延伸到线虫模型，并可能为人类疾病机制提供线索。
该研究建立的高通量ECIA平台和改进的数据分析方法，为未来在其他模式生物乃至人类中开展更全面的胞外互作组研究奠定了技术基础。随着基因合成成本下降和功能验证手段的丰富，最终实现完整胞外互作组的绘制将成为可能，从而系统性地揭示细胞表面和分泌蛋白在健康与疾病中的功能逻辑。这项研究不仅为线虫生物学提供了宝贵资源，其发现的理论和工具也将惠及整个生命科学领域，推动对神经元连接、细胞间通讯、粘连以及衰老和疾病相关信号通路的深入理解。
