《Cell Systems》：Rewriting endogenous human transcripts with dual CRISPR-guided 3′ trans-splicing
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本研究针对RNA编辑领域难以实现高效、特异性外显子替换的难题，开发了名为RESPLICE的双CRISPR效应器引导反式剪接技术。通过dCasRx模块促进靶向反式剪接，Cas7-11模块抑制顺式剪接，实现在3种细胞系中11个内源性转录本上最高45%的反式剪接效率。该技术为遗传病治疗和蛋白质功能研究提供了可编程、瞬时的RNA编辑新工具。
在生命科学领域，精准调控基因表达一直是研究人员追求的目标。与传统基因组编辑相比，RNA编辑具有瞬时性、可逆性和安全性高等优势，为治疗遗传性疾病提供了新思路。然而，现有的RNA编辑技术主要局限于单个核苷酸的修改或外显子跳跃，难以实现大片段外显子的替换或添加。许多疾病相关的转录本异常，如致病性外显子突变、蛋白质截短或重复序列扩展，都需要更高效的RNA编辑工具来修复。
长期以来，科学家们尝试利用天然的反式剪接（trans-splicing）机制，将外源外显子连接到目标转录本上。但传统的RNA-only方法（如SMaRT技术）效率低下，且缺乏特异性，严重限制了其应用。尽管剪接体介导的反式剪接在理论上具有广阔前景，但在内源性人类转录本中实现高效、特异性的反式剪接一直是个巨大挑战。
为了解决这些问题，由Chandrasekaran, Tau等研究人员在《Cell Systems》上发表了题为“Rewriting endogenous human transcripts with dual CRISPR-guided 3′ trans-splicing”的研究论文，开发了一种名为RESPLICE（RNA-guided trans-splicing with Cas editor）的新型RNA编辑技术。该技术利用两种不同的CRISPR效应器，通过程序化方式促进外显子反式剪接到人类转录本中，同时抑制内源性顺式剪接（cis-splicing），实现了高效、特异性的转录本重编程。
研究团队主要采用了双CRISPR效应器策略（dCasRx和Cas7-11）、双色荧光报告系统、数字液滴PCR（ddPCR）和RNA测序（RNA-seq）等技术。通过设计反式剪接模块（TSM）和顺式剪接干扰模块（CIM），在HEK293T、Huh7和Neuro-2a细胞系中进行了系统验证。
RNA-targeting CRISPR-Cas13d guides site-specific trans-splicing
研究人员首先利用催化失活的Cas13d（dCasRx）引导反式剪接模块（TSM）靶向报告基因转录本。通过双色荧光报告系统（GFP/BFP）评估反式剪接效率，发现dCasRx可将效率提高约6倍，最高达到30%。通过系统比较多种RNA靶向CRISPR效应器（包括hfCasRx、Cas7-11等），确定dCasRx在效率和特异性方面表现最优。RNA-seq分析显示，该系统具有95.3%的靶向特异性，且脱靶事件发生率低。
Inhibiting cis-splicing with a second CRISPR ribonuclease boosts trans-splicing efficiency
为了进一步提高效率，研究团队引入了第二个催化活性CRISPR效应器（CIM），用于切割目标转录本下游区域，抑制内源性顺式剪接。当使用Cas7-11作为CIM时，反式剪接效率可提升1.4倍，最高达到55%。数字液滴PCR验证表明，CIM的加入使反式剪接效率从4%提升至8%，且不降低目标转录本的总表达水平。
RESPLICE efficiently trans-splices cargo exons onto endogenous human transcripts
研究团队将RESPLICE技术应用于11个内源性人类转录本，包括ITGB1、TFRC、SMARCA4等。通过优化TSM和CIM的靶向位点，在ITGB1转录本上实现了47.4%的反式剪接效率。在分选高效应器表达的细胞中，效率可达90%。值得注意的是，该系统可处理长达2.1 kb的外显子 cargo，展示了其处理大片段的能力。RNA-seq分析证实，RESPLICE在内源性转录本中具有高特异性，脱靶事件主要呈随机分布，且对细胞转录组影响较小。
RESPLICE can be used for endogenous protein tagging and pathogenic mutation correction
作为应用示范，研究团队成功将GFP标签反式剪接到LAMP1蛋白C端，实现了内源性蛋白质标记。在疾病相关转录本修正方面，RESPLICE成功靶向了HFE（遗传性血色素沉着症相关）、C9orf72（ALS/FTD相关重复扩展）和TDP43（肌萎缩侧索硬化症相关）等基因。特别是在HFE转录本修正中，在Huh7细胞中实现了8%的效率，证明了其在治疗应用中的潜力。
研究结论表明，RESPLICE技术首次实现了在内源性人类转录本中高效、特异性的反式剪接，突破了现有RNA编辑技术的局限性。通过双CRISPR效应器策略，该技术成功解决了反式剪接与顺式剪接竞争的问题，为RNA医学领域提供了新的工具。
在讨论部分，作者指出剪接体的天然混杂性可能导致低水平脱靶反式剪接，但RNA-seq数据显示这些事件发生频率低于基础剪接错误率，预计不会对细胞功能产生显著影响。与研究同期发表的其他反式剪接技术（如Splice Editing、PRECISE和CRAFT）相比，RESPLICE在效率和特异性方面展现出独特优势。
该研究的重要意义在于为遗传病治疗提供了新策略，特别是针对具有高度突变异质性的疾病（如囊性纤维化、莱伯先天性黑蒙）或重复扩展障碍（如ALS/FTD）。同时，RESPLICE为基础研究提供了新手段，可用于蛋白质功能研究、亚细胞定位标记和转录本动力学分析。由于RNA编辑的瞬时特性，该技术还具有较高的安全性，有望成为基因治疗领域的有力补充。
然而，研究也存在一定局限性，如目前仅在细胞系中验证，尚未在动物模型或原代细胞中测试；双蛋白系统的体内递送仍是挑战；且未探索5′反式剪接的应用。未来研究将着重优化递送系统、扩展应用场景，并进一步评估其安全性和有效性。
总之，RESPLICE技术的开发标志着RNA编辑领域的重要进展，为实现精准、可控的转录组工程奠定了坚实基础，为遗传病治疗和基础科学研究开辟了新途径。
