《SCIENCE ADVANCES》：Mesothelial cells promote peritoneal invasion and metastasis of ascites-derived ovarian cancer cells through spheroid formation
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上皮性卵巢癌EOC患者常伴有腹膜转移和腹水，但腹水中的非恶性细胞如何与癌细胞相互作用、进而促进腹膜转移的机制尚不明确。为此，研究人员通过多光子显微镜观察、单细胞RNA测序分析、体外3D侵袭模型及小鼠体内实验，系统研究了源自腹水的卵巢癌细胞与间皮细胞形成的“聚集性癌-间皮细胞球体（ACMSs）”在腹膜侵袭和转移中的作用。研究发现，间皮细胞是腹水的主要成分，癌细胞可迅速与其形成ACMSs，并且ACMSs中的间皮细胞在TGF-β1刺激下发生显著转变，通过上调fascin-1促进侵袭伪足形成，从而率先侵袭胶原和间皮层，为后续癌细胞的扩散铺平道路。该研究揭示了卵巢癌在腹腔内快速播散的新机制，为开发针对ACMSs或相关信号通路的治疗策略提供了新思路。
上皮性卵巢癌EOC是女性生殖系统中最致命的癌症之一。超过75%的患者在确诊时已处于晚期，这很大程度上是因为该病早期缺乏特异性症状，且缺乏有效的筛查手段。更棘手的是，一旦在卵巢或输卵管形成，EOC能迅速转移至腹腔内的其他器官，这种通过腹水在体腔内播散的转移方式被称为“经体腔扩散”，是EOC的独特特征。患者腹腔内积聚的腹水不仅含有癌细胞，还含有大量如巨噬细胞、淋巴细胞和间皮细胞等非恶性细胞。尽管先前的研究表明癌细胞可以在腹水中形成被称为“癌球体”的聚集体，并且这些球体可能帮助癌细胞抵抗因脱离细胞外基质而引发的失巢凋亡，但EOC细胞究竟如何在腹水中生存、如何与腹水肿瘤微环境中的细胞相互作用进而诱导腹膜播散，以及为何要与周围细胞形成异质性球体，这些问题仍不完全清楚。特别是在腹水中占主导地位的间皮细胞，它们作为腹膜表面的保护层，本应起到屏障作用，但研究显示它们在炎症或癌症环境中形态和蛋白表达会发生显著变化，甚至与癌细胞共享部分标记物，这使得它们在EOC进展中的作用显得复杂而矛盾。为了阐明卵巢癌细胞在腹水微环境中存活并快速诱导腹膜转移的机制，研究人员在《SCIENCE ADVANCES》杂志上发表了一项深入研究。
为开展这项研究，作者运用了多项关键技术方法。研究首先基于包含1856名卵巢癌患者的多机构队列数据（Tokai Ovarian Cancer Group），通过回顾性分析评估了腹水细胞学阳性与患者预后的关联。利用临床腹水样本的细胞学涂片和细胞块，通过巴氏染色、免疫组织化学IHC和免疫荧光IF对细胞形态和组成进行了详细评估。通过单细胞RNA测序scRNA-seq技术，重新分析了已发表的多个EOC数据集，以明确腹水中间皮细胞的转录特征和占比。在体外，建立了“聚集性癌-间皮细胞球体（ACMSs）”模型，并利用旋转培养系统模拟腹水环境观察球体形成动力学。核心功能实验包括三维3D胶原侵袭实验、体外间皮细胞清除实验以及人网膜组织的离体外植体侵袭模型，以评估ACMSs的侵袭能力。通过RNA测序分析了ACMSs中癌细胞和间皮细胞的基因表达变化，并进行通路富集分析。在体内，利用荧光标记的卵巢癌细胞和间皮细胞构建了小鼠恶性腹水模型，并通过活体成像系统IVIS追踪肿瘤负荷。此外，还使用了Wt1-CreERT2; tdTomato报告基因小鼠进行谱系追踪，证实了球体中存在间皮细胞。最后，通过蛋白质印迹、qPCR、Transwell实验、侵袭伪足染色及特异性抑制剂/小干扰RNAsiRNA/短发夹RNAshRNA敲低等手段，深入探究了TGF-β1和fascin-1信号轴在间皮细胞获得侵袭表型中的关键作用。
研究结果：
卵巢癌细胞以球体形式存在，间皮细胞是腹水的主要成分
回顾性数据分析显示，腹水细胞学阳性与更短的I期患者无进展生存期显著相关。对临床腹水样本的形态学分析发现，几乎所有的EOC细胞（99.5%）都以球体形式存在，而非单个细胞。通过评估非恶性细胞的形态学特征以及重新分析多个已发表的EOC单细胞RNA测序数据集，研究人员证实间皮细胞是腹水中最主要的基质细胞类型，占基质细胞的90%以上，其表达水平在腹水样本中显著高于原发和转移肿瘤。这纠正了先前一些研究中将腹水中间皮细胞误判为“成纤维细胞”的情况。
HBME1可用于区分癌球体中的间皮细胞
由于间皮细胞与EOC细胞共享一些标记物，研究通过筛选多种标记物，发现HBME1能有效区分二者。在临床腹水细胞块和通过Percoll法富集的多光子显微镜观察中，HBME1能清晰地显示出癌球体中的间皮细胞成分。对383个来自高级别浆液性卵巢癌HGSOC患者的癌球体分析显示，超过60%的球体中含有间皮细胞。有趣的是，化疗后患者腹水球体中间皮细胞的比例显著增加。此外，利用Wt1-CreERT2; tdTomato报告小鼠模型进行谱系追踪，也证实了小鼠恶性腹水中的癌球体由GFP标记的ID8癌细胞和tdTomato标记的间皮细胞共同组成。
间皮细胞存在于卵巢癌球体中，形成具有侵袭性的ACMSs
体外实验表明，EOC细胞能迅速与间皮细胞，特别是经转化生长因子-β1TGF-β1刺激的间皮细胞，形成更紧密、更稳固的聚集性癌-间皮细胞球体（ACMSs）。与仅由EOC细胞组成的同型球体相比，ACMSs的形成速度更快，聚集性更强。更重要的是，在三维胶原侵袭实验中，ACMSs表现出极强的侵袭能力，其侵袭面积远大于同型球体。值得关注的是，是球体中的红色标记间皮细胞率先侵入胶原层，绿色标记的EOC细胞随后沿着间皮细胞开辟的路径跟进。在体外间皮细胞清除实验中，也观察到了同样的模式：ACMSs中的间皮细胞作为“先导细胞”首先侵入间皮层，为后续癌细胞的移动打开通道。
ACMSs中的间皮细胞率先侵袭，在离体和体内诱导腹膜转移
在利用人网膜组织建立的离体外植体模型中，ACMSs能诱导比同型球体更多的播散灶，且间皮细胞的侵袭长度显著大于EOC细胞。在小鼠体内恶性腹水模型中，注射后仅2-4小时，EOC细胞就能与间皮细胞在腹水中形成球体。与仅注射EOC细胞的小鼠相比，共注射EOC细胞和间皮细胞的小鼠，其腹水中球体数量更多，网膜和肠系膜上的转移灶数量更多、面积更大。活体成像也显示，共注射组小鼠的腹膜肿瘤负荷显著更高。在转移灶边缘，同样是间皮细胞位于侵袭前沿，而EOC细胞位于中心区域。
EOC细胞通过ACMS形成改变间皮细胞的RNA表达谱
通过流式细胞术分选ACMSs中的两种细胞并进行RNA测序发现，与间皮细胞共形成球体后，EOC细胞的基因表达变化相对较小，而间皮细胞的RNA表达谱发生了显著改变，有455个基因上调。通路分析显示，间皮细胞中Notch、PI3K-Akt、MAPK和TGF-β等通路显著上调。对腹水样本的单细胞测序数据进行通路活性分析，也证实了间皮细胞中TGF-β通路活性较高。实验表明，TGF-β1刺激能显著增加间皮细胞侵袭伪足的数量。在TGF-β1刺激的间皮细胞中，与侵袭伪足形成相关的蛋白fascin-1和myosin X表达上调，并定位于侵袭伪足处。
EOC细胞来源的TGF-β1将间皮细胞转化为侵袭性先导表型
功能实验证实，TGF-β1刺激的间皮细胞具有更强的迁移、侵袭和胶原降解能力。当使用siRNA敲低EOC细胞中的TGF-β1，或用TGF-β1受体阻断剂预处理间皮细胞，再形成ACMSs时，其侵袭能力被显著抑制。同样，在体内实验中，注射TGF-β1敲低的EOC细胞，小鼠腹水中形成的球体更少、更小，网膜转移面积和间皮细胞的侵袭深度也显著降低。临床数据表明，超过50%的晚期卵巢癌患者腹水中TGF-β1浓度超过10 ng/ml。
由fascin-1介导的侵袭伪足形成赋予间皮细胞侵袭能力，其基质表达与不良预后相关
单细胞测序数据显示，FSCN1、MMP14等侵袭相关基因在腹水间皮细胞中高表达。抑制fascin-1功能（使用抑制剂NP-G2-044或shRNA敲低）或敲低myosin X，能显著减少间皮细胞侵袭伪足的数量，并削弱ACMSs的体外侵袭能力和小鼠体内的成瘤能力。对临床转移样本的免疫组化分析发现，fascin-1在转移灶侵袭前沿的基质细胞中高表达，而在癌细胞中表达水平较低。生存分析表明，转移灶基质细胞中fascin-1的高表达与患者更短的无进展生存期显著相关，而癌细胞中的表达则无此关联。
研究结论与讨论：
这项研究揭示了一个新的模型，解释了EOC细胞如何在腹水中快速播散。研究发现，腹水中的EOC细胞绝大多数以球体形式存在，其中超过60%是与间皮细胞共同形成的聚集性癌-间皮细胞球体（ACMSs）。ACMSs的形成使EOC细胞能够通过TGF-β相关通路显著改变间皮细胞的RNA表达谱。这些变化上调了fascin-1的表达，进而促进间皮细胞中侵袭伪足的成熟，并通过基质金属蛋白酶14（MMP14）降解胶原。间皮细胞因此获得侵袭性，率先侵入胶原和间皮层，而EOC细胞则无需自身发生剧烈的基因表达改变，只需跟随间皮细胞开辟的路径即可完成转移。这一发现阐明了卵巢癌细胞通过“劫持”并“改造”腹水中的间皮细胞，将其从保护性屏障转变为侵袭“先导”，从而在腹腔内快速诱导广泛腹膜转移的独特机制。该研究强调了腹水微环境，特别是间皮细胞在EOC转移中的核心作用。研究结果指出，针对ACMSs形成过程、TGF-β1信号轴或间皮细胞侵袭的关键执行者（如fascin-1）进行干预，可能成为抑制卵巢癌腹膜转移的新策略。同时，研究也提示，在分析腹水等特殊微环境的单细胞测序数据时，需注意细胞类型注释的准确性，充分考虑间皮细胞的存在和特性。总之，这项研究不仅增进了对卵巢癌转移生物学的理解，也为开发新的治疗手段提供了潜在靶点。
