《SCIENCE ADVANCES》：Bacterial metabolic remodeling by convergent evolution unlocks nutrient availability after a host switch
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本研究针对宿主转换后细菌如何适应新生态位营养环境这一关键科学问题，通过多组学技术系统揭示了牛源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)通过蛋白酶aureolysin(Aur)介导的酪蛋白降解机制实现代谢重塑。研究发现不同谱系菌株通过调节agr系统等途径趋同进化获得Aur高表达表型，显著提升在牛奶中的增殖能力，为理解多宿主病原体适应性进化提供了重要范式。
在微生物进化研究领域，病原体如何通过宿主转换事件适应新生态环境一直是科学家关注的焦点。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)作为一种典型的多宿主病原体，不仅造成沉重的人类疾病负担，更是奶牛乳腺炎的主要致病菌。值得关注的是，现有的牛源金黄色葡萄球菌谱系均可追溯至少数几次从人类到牛群的独立宿主转换事件，这表明该病原体在跨越物种屏障后发生了显著的适应性进化。然而，人们对细菌在宿主转换过程中如何重构代谢网络以适应新宿主特定营养环境的分子机制仍知之甚少。
近日发表在《科学进展》(SCIENCE ADVANCES)的研究论文，通过整合基因组学、转录组学和功能实验等多学科方法，系统揭示了牛源金黄色葡萄球菌在宿主转换后发生的代谢重塑现象。研究团队发现，与人类源菌株相比，牛源菌株进化出了通过蛋白酶介导的酪蛋白降解能力，从而有效利用牛奶中丰富的蛋白质资源。这一适应性表型在不同金黄色葡萄球菌谱系中通过 distinct 基因位点的突变趋同进化而来，均导致蛋白酶aureolysin(Aur)的过表达。该研究不仅阐明了细菌宿主适应的关键机制，也揭示了病原体在面临新生态位挑战时展现出的惊人进化可塑性。
研究团队主要采用了以下关键技术方法：首先建立了包含365株牛源和人源金黄色葡萄球菌的菌株库进行表型筛选；利用RNA测序技术比较不同菌株在牛奶环境中的转录组差异；通过基因编辑技术构建蛋白酶基因缺失株和互补株进行功能验证；采用基因组-wide关联分析(GWAS)和比较基因组学方法追溯表型相关的遗传变异；使用Western blot和酶活性测定分析Aur蛋白酶的表达和功能。
牛源金黄色葡萄球菌谱系表现出与牛奶中增强生长相关的凝固现象
研究人员通过离体牛奶感染实验发现，60.6%的牛源菌株在培养4-6小时后产生牛奶凝固现象（分离为固体凝块和液体乳清），而人源菌株仅13.2%表现出该表型。值得注意的是，凝固表型的频率在不同谱系间存在差异，长期适应反刍动物的全球分布谱系如CC97、CC133和CC151凝固频率最高（72.8%-90.5%），而近期与牛群相关的谱系如CC1、CC30和CC188凝固频率较低（20%-40%）。生长实验表明，具有凝固表型的牛源菌株在牛奶中的生长产量显著高于非凝固菌株，而在丰富培养基(TSB)中无差异，证实该表型与牛奶环境特异性相关。
系统发育分析显示牛奶凝固表型呈并系分布
最大似然系统发育分析显示，牛奶凝固表型在多数克隆复合体(CC)中呈并系分布。对于凝固频率高的谱系（CC97、CC133和CC151），系统发育表明各谱系最近共同祖先均具有凝固能力，而在进化历史中发生了零星的表型丢失事件。相反，凝固频率较低的牛源谱系（CC1、CC30、CC45、CC188和CC350）则表现出零星的表型获得事件，提示最小遗传变异可能足以赋予或丧失凝固表型。
牛源金黄色葡萄球菌在牛奶中生长的转录组分析揭示适应性代谢重塑
转录组分析发现，牛源和人源菌株在丰富培养基(TSB)中基因表达相似，但在牛奶培养基中形成明显分离的聚类。在牛奶中，牛源菌株（无论是否凝固）与人源菌株相比有726个基因差异表达，其中71.9%注释与代谢相关。牛源菌株表现出缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸（支链氨基酸）生物合成、精氨酸生物合成和半乳糖代谢相关基因的表达上调，而凝固菌株中脲酶和嘌呤代谢基因表达下调。特别值得注意的是，细胞外蛋白酶编码基因在凝固菌株中表达显著升高。
牛奶凝固表型依赖于蛋白酶aureolysin
转录组数据显示，aureolysin(Aur)基因在牛源凝固菌株中的表达比牛源非凝固菌株高14.5倍，比人源非凝固菌株高37倍。Western blot分析证实，六对表型相反的相关菌株中，凝固菌株的Aur蛋白表达均高于非凝固菌株。功能实验表明，在蛋白酶缺陷菌株USA300Δprotease中表达Aur可诱导牛奶凝固，而删除牛源凝固菌株的aur基因则消除或延迟凝固表型。值得注意的是，sspA基因的缺失不影响凝固表型，表明Aur的作用不依赖于下游蛋白酶。
Aureolysin介导酪蛋白消化、牛奶凝固并促进牛源金黄色葡萄球菌在牛奶中的增强生长
研究发现Aur能够剂量依赖性降解荧光标记的酪蛋白，并消化α、β和κ酪蛋白链。只有Aur或其浓缩上清可诱导牛奶凝固，且该过程可被EDTA抑制。生长实验证实，Aur缺失导致牛源凝固菌株在牛奶中生长减弱，而Aur（非SspA）的过表达可增强非凝固牛源菌株在牛奶中的生长，但对人源菌株无生长促进作用，表明牛源菌株的代谢重塑是Aur依赖性生长增强的基础。
全基因组关联分析揭示与牛源金黄色葡萄球菌群体中零星凝固表型丢失相关的突变
GWAS分析发现两个与表型显著相关的unitig，均映射到agr表达转录促进因子sarZ的DNA结合位点。序列比对显示，非凝固菌株中存在sarZ DNA结合位点的错义变异、导致提前终止密码子的无义突变以及导致sarZ基因截短的独特遗传事件。由于sarZ是agr系统的正调控因子，而agr控制aureolysin表达，这些功能改变性单核苷酸多态性(SNP)可能间接导致凝固表型丢失。
凝固表型进化遗传基础的比较基因组学分析
通过定制生物信息学流程，研究人员分析了四个功能获得(GOF)事件和四个功能丧失(LOF)事件。GOF分析发现不同谱系中导致凝固表型的突变位于不同基因，无共同SNP，表明趋同进化。LOF分析发现，四个LOF事件中agrC均含有独特SNP，包括移码突变和提前终止密码子。序列比对发现另外三个CC350非凝固菌株在agrC中含有相同移码突变。将功能性agr系统导入天然agr缺陷的非凝固菌株可增强Aur表达并恢复凝固表型，证实agr在调控aureolysin表达中的关键作用。
研究结论与讨论部分强调，作为通用型病原体，金黄色葡萄球菌通过重构现有代谢途径，趋同进化出利用新宿主特异性底物营养的能力。牛源菌株进化出增强的乳糖利用能力、支链氨基酸和精氨酸生物合成能力，以及Aur介导的酪蛋白降解机制。Aur的高表达由不同谱系中不同基因或通路的 distinct 突变所导致，支持多种进化轨迹可导致相同适应性表型的观点。大多数牛源菌株具有凝固和生长增强表型，但全球优势克隆(CC97和CC151)比近期出现的地方性克隆(CC1、CC30等)频率更高，可能反映后者对乳业生态位适应不完全，或Aur高表达在非乳环境中存在适应性代价。
该研究揭示了细菌通过趋同进化重塑代谢机制以适应新宿主环境的分子基础，强调了金黄色葡萄球菌在扩张至新宿主生态位时表现出的显著进化可塑性。这些发现对理解多宿主病原体的适应性进化机制具有重要意义，为开发针对病原体宿主适应性机制的干预策略提供了新视角。
