《SCIENCE ADVANCES》：RTX-family toxin EhxA drives morphological remodeling and thrombogenesis in RBCs during enterohemorrhagic Escherichia coli infection
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本研究揭示了肠出血性大肠杆菌(EHEC)感染中RTX家族毒素EhxA通过介导Ca2+内流和磷脂酰丝氨酸(PS)外化，驱动红细胞从盘状细胞向棘状细胞、球状细胞的形态转变，并促进凝血酶生成、红细胞-内皮细胞粘附和红细胞自聚集，最终导致静脉血栓形成。这一发现不仅阐明了EHEC感染中红细胞介导的血栓形成新机制，也为防治毒素诱导的凝血功能障碍提供了新靶点。
当人们谈论肠出血性大肠杆菌(EHEC)感染时，通常会想到其产生的志贺毒素(Stx)导致的溶血性尿毒综合征(HUS)。这种严重并发症以微血管病性溶血性贫血和急性肾损伤为特征，但其具体发病机制仍存在诸多未解之谜。特别令人困惑的是，红细胞(RBC)在这种血栓性微血管病中究竟扮演什么角色？传统观点认为红细胞只是被动受害者，但最新证据表明，这些携氧细胞可能主动参与了凝血过程。
在EHEC感染过程中，红细胞会发生显著的形态变化，从正常的双凹盘状细胞(discocyte)转变为带有棘状突起的棘状细胞(echinocyte)，最终变成球状细胞(spherocyte)。同时，红细胞膜上的磷脂酰丝氨酸(PS)会外翻暴露，形成促凝表面，促进凝血酶生成。然而，驱动这一系列变化的关键毒力因子及其分子机制尚不明确。是众所周知的志贺毒素，还是其他未被重视的细菌毒素在起作用？这个问题一直困扰着研究人员。
为了解决这一科学难题，研究人员在《科学进展》(SCIENCE ADVANCES)上发表了最新研究成果。他们发现EHEC产生的RTX家族毒素——肠溶血素EhxA，才是驱动红细胞形态重塑和血栓形成的关键因子。与预期相反，著名的志贺毒素Stx2在这一过程中并不起作用。
研究团队运用了多种前沿技术方法，包括利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建ehxA和stx2基因敲除株，通过流式细胞术检测PS暴露和微囊泡(MV)生成，使用透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)观察红细胞形态变化，采用原核生物基因组注释管道(PGAP)进行转录组分析，并建立大鼠静脉血栓模型进行体内验证。实验所用红细胞来自健康志愿者，细菌菌株为EHEC O157:H7 EDL933。
钙依赖性PS暴露和EHEC感染红细胞中的促凝激活
研究人员发现，EHEC感染可诱导红细胞内Ca2+浓度依赖性升高，激活caspase-3和 scramblase活性，同时抑制flippase活性，导致PS外露。这种PS暴露为凝血因子组装提供了平台，显著增强了凝血酶生成。
钙驱动机制介导EHEC感染中的PS暴露和红细胞形态变化
通过电子显微镜观察，研究团队首次详细记录了EHEC感染导致的红细胞形态转变过程：从盘状细胞到棘状细胞，最终形成球状细胞。这种形态变化与PS暴露呈强正相关，而钙螯剂EGTA或PS阻断剂annexin V处理均可抑制这一过程。
Stx2对红细胞促凝活性和形态无贡献
令人意外的是，转录组分析显示ehxA基因显著上调，而stx基因未见明显诱导。stx2敲除株与野生株在诱导PS暴露、形态变化等方面无差异，纯化Stx2蛋白也无法重现这些表型，表明Stx2不参与红细胞介导的血栓形成过程。
揭示EhxA在EHEC诱导的PS暴露和形态变化中的关键作用
ehxA敲除株几乎完全丧失了诱导Ca2+内流、PS暴露、形态变化和凝血酶生成的能力。多元线性回归分析确认PS暴露是红细胞形态变化和促凝活性的主要预测因子。
EhxA作为EHEC感染红细胞中促血栓活性的关键介质
除凝血酶生成外，EhxA还介导红细胞与内皮细胞(HUVEC)的粘附以及红细胞自聚集，这些效应均与PS暴露程度密切相关。
遗传互补和纯化蛋白实验证实EhxA在红细胞促凝活性和重塑中的核心作用
通过基因互补实验，重新引入ehxA可恢复所有表型至野生型水平。在无细菌条件下，纯化EhxA蛋白能重现Ca2+内流、PS暴露和形态变化，且免疫荧光显示EhxA定位于完整红细胞膜上。
大鼠体内EHEC感染中EhxA依赖性红细胞形态重塑和静脉血栓形成
在大鼠模型中，野生型EHEC感染可诱导红细胞形态重塑并增强静脉血栓形成，而ehxA敲除株则无此效应，证实了EhxA在体内的关键作用。
这项研究系统阐明了EhxA-Ca2+-PS通路在EHEC感染中驱动红细胞形态重塑和促凝激活的分子机制。研究发现不仅将RTX家族毒素的功能扩展到红细胞介导的血栓形成领域，还揭示了细菌病原体调控宿主凝血系统的一种新型策略。特别重要的是，该研究颠覆了传统认知，证明在红细胞模型中，EhxA而非Stx2是主要的促血栓因子。
从更广泛的视角看，这项工作提示RTX毒素可能代表了一类病原体共享的 virulence因子，通过相似机制调控红细胞功能进而影响宿主凝血平衡。这为理解多种细菌感染相关的血栓并发症提供了新框架，也为开发针对毒素诱导凝血障碍的治疗策略指明了新方向。针对EhxA的中和抗体、钙通道阻滞剂或PS外露抑制剂等，未来可能成为防治EHEC感染血栓并发症的有效手段。
该研究的另一重要价值在于方法学创新，通过多元回归分析建立了PS暴露与红细胞形态变化、促凝活性之间的定量关系，将PS从生物标志物提升为机制核心。这种分析框架为未来研究病原体-宿主相互作用提供了新范式。
总之，这项工作不仅深化了对EHEC发病机制的理解，更开辟了红细胞在感染性疾病中作用研究的新领域，为应对细菌感染相关的血栓性并发症提供了新的理论基础和治疗思路。
