《The European Zoological Journal》：Leucism recording and skin alterations in the Arabian tadpole (Sclerophrys arabica) (Heyden, 1827) in AlUla, Saudi Arabia
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本综述首次报道了沙特阿拉伯AlUla地区阿拉伯蟾蜍（Sclerophrys arabica）幼体白化（leucism）现象，通过形态学观察、组织学（H&E、PAS染色）、超微结构（TEM）、免疫组化（CTGF、GFAP）及分子系统发育（mt16S rRNA）分析，揭示白化个体皮肤黑色素缺失、表皮结构异常、碳水化合物含量降低及关键蛋白表达下调等特征，为两栖动物色素细胞在变态发育中的功能及环境适应性研究提供重要案例。
ABSTRACT
白化（leucism）是一种因黑色素缺乏及色素细胞（chromatophores）发育或分布异常导致的颜色变异。本研究首次记录了沙特阿拉伯AlUla地区阿拉伯蟾蜍（Sclerophrys arabica）白化幼体的发生。样本在实验室内饲养至变态发育结束，历时四个月。通过基因组DNA提取、聚合酶链式反应（PCR）扩增和线粒体16S核糖体RNA（16S rRNA）基因测序，对正常与白化幼体进行分子鉴定。白化个体体表透明，内脏可见。组织学研究表明，白化个体皮肤存在表皮结构改变、黑色素细胞（melanophores）缺失或减少、碳水化合物含量降低、结缔组织生长因子（CTGF）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达下降等现象。系统发育树显示正常与白化蟾蜍聚为一支，鉴定为S. arabica（Heyden, 1827）。研究结论认为色素细胞在变态发育过程中起重要作用，建议进一步探究该现象的成因。
1. 引言
阿拉伯蟾蜍（Sclerophrys arabica）是沙特阿拉伯、阿曼、阿联酋和也门特有的蟾蜍科物种，体色多样（绿色、棕褐色或灰色）。动物体色在抵御视觉捕食者、性别识别、个体适应度及繁殖能力等方面具有重要功能。两栖动物皮肤颜色由六类色素细胞（黑色素细胞、黄色素细胞、青色素细胞、红色素细胞、虹彩细胞和白色素细胞）的反射作用决定，其存在、变异、缺失或平衡改变会影响皮肤外观。颜色异常包括黑色素减少症、白化、白变病、黄色素缺失、异常赭色斑块、无黑化、花斑病、红色素增多症及黑化症等。白化指皮肤和眼中黑色素缺乏及色素细胞分布紊乱，是一种常见的两栖动物颜色变异。完全白化个体表现为红眼和白色皮肤，部分白化（即白化）个体则具有正常黑色虹膜。白化动物对日光敏感性和视力障碍较完全白化个体轻。野外白化个体因缺乏保护色易被捕食，且可能影响种内配偶识别，因此自然环境中罕见。本研究旨在报告沙特阿拉伯AlUla地区阿拉伯蟾蜍白化病例，深化对自然系统中白化动态的理解。
2. 材料与方法
2.1. 样本采集
研究涉及两个地点：Almminshia区（26°35′04.8″N, 37°56′52.2″E）和al-Wared Dam区（26°56′33.4″N, 37°24′25.7″E）。分别于2019年2月15日和2022年2月19日采集阿拉伯蟾蜍幼体（各50尾和160尾），使用浮游生物网（网孔直径50 μm）收集。幼体在实验室水族箱中饲养，每日更换曝气除氯水，投喂生菜或菠菜叶片。实验获得埃及索哈杰大学科学学院科学研究伦理委员会批准（批号CSRE-2–25）。在发育阶段25、31、45取正常与白化幼体（各10尾）进行麻醉、固定和保存。使用体视显微镜（Leica EZ4HD）拍摄形态特征。变态完成后收集正常与白化幼蟾各5只，饲养于湿润塑料杯中，投喂小型蚂蚁。
2.2. 组织学、组织化学、免疫组化及超微结构研究
取阶段45的正常与白化蝌蚪制备石蜡切片，进行苏木精-伊红（H&E）染色、过碘酸希夫（PAS）反应检测碳水化合物，以及CTGF和GFAP免疫组化染色（一抗为兔多克隆抗CTGF和抗GFAP，二抗为生物素化羊抗兔IgG，DAB显色）。超微结构样本经2.5%戊二醛和1%锇酸固定，环氧树脂（EPON）包埋，超薄切片铀铅染色后透射电镜（JEOL JEM 1010）观察。
2.3. DNA测序
取正常与白化蟾蜍皮肤样本，送韩国Macrogen基因组中心提取基因组DNA，扩增线粒体16S rRNA基因（引物16SL-F和16SH-R，约550 bp）。PCR产物纯化后测序，序列上传NCBI获取登录号（正常个体PQ272044，白化个体PQ246122）。使用MEGA软件进行序列比对、遗传距离计算和系统发育树构建。
3. 结果
3.1. 形态学观察
Almminshia区50尾蝌蚪中仅发现1尾阶段31白化个体，实验室饲养两月后死亡未完成变态。al-Wared Dam区160尾蝌蚪中包含120尾正常黑色和40尾白化个体（阶段25，体长18.8 mm）。白化个体表现为全身色素缺失、皮肤呈淡黄色，但阶段31和45时眼睛颜色正常。阶段45尾部开始退化，白化蝌蚪皮肤无色素、血管可见。体视显微镜下，正常蝌蚪皮肤黑色素细胞分布正常，白化个体透明、内脏略可见、黑色素细胞缺失。白化个体发育延迟，最大体长13.0 mm（正常个体14.2 mm），避光行为明显。5只白化幼蟾在变态完成后1–5天内死亡，无法适应实验室水陆环境，正常个体饲养两周后放归原采集地。
3.2. 组织学、组织化学、超微结构及免疫组化分析
正常蝌蚪皮肤由表皮和真皮构成，含表皮与真皮黑色素细胞、黏液腺和毒腺。白化个体皮肤真皮黑色素细胞分布减少、树突缺失，表皮细胞核萎缩、染色质异常凝聚、黑色素缺失。PAS反应显示白化个体表皮、黏液腺和毒腺周围碳水化合物含量显著降低。免疫组化表明白化个体皮肤CTGF和GFAP表达减少。
3.3. 分子分析
正常与白化个体mt16S rRNA基因PCR扩增成功，系统发育树显示二者与S. arabica（KT031422.2）聚为一支，遗传距离矩阵值为0.0075，支持其为同一物种。
4. 讨论
本研究首次报道沙特阿拉伯AlUla地区阿拉伯蟾蜍白化现象。白化可能由隐性基因（alb）纯合、遗传隔离、近亲繁殖或遗传漂变引起，环境胁迫（如光污染、重金属、农药）也可能诱发色素异常。al-Wared Dam地区自然隔离性强，可能促进隐性基因表达。白化个体发育延迟、变态后存活率低，与皮肤结构异常、关键分子表达下调及捕食压力增加有关。组织与超微结构表明白化个体皮肤屏障功能受损，细胞活力下降。分子系统发育确认白化表型不改变物种遗传身份。
5. 结论
本研究首次记录沙特阿拉伯AlUla地区阿拉伯蟾蜍白化现象，证实黑色素细胞在幼体发育中起关键作用，其缺失导致皮肤结构及分子表达异常。建议进一步研究该现象的成因及其在自然系统中的生态影响。
