《Research》：Lycopene Antagonizes Deoxynivalenol-Induced Porcine Intestinal Epithelial Cell Senescence by Inhibiting TXNIP-Mediated NLRP3 Inflammasome Activation
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为揭示常见霉菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）所致肠道损伤的新机制并探寻干预策略，本研究聚焦于TXNIP-NLRP3炎症小体通路，发现天然抗氧化物番茄红素（LYC）可靶向TXNIP，抑制NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡，从而有效延缓DON诱导的猪肠道上皮细胞衰老，为防治霉菌毒素相关肠道疾病提供了新的潜在靶点。
霉菌毒素是真菌产生的次级代谢产物，对全球生态和人类健康构成持续性威胁。其中，脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）作为一种极为普遍的污染性霉菌毒素，广泛存在于玉米、小麦等谷物及其制品中，全球污染率超过60%。由于DON具有高度的化学稳定性和耐热性，它在食品加工和储存过程中难以被破坏，极易通过食物链在人体和动物体内富集，引发包括恶心、呕吐、腹痛、腹泻、食欲减退和体重下降等一系列胃肠道及全身性症状。其肠道毒性尤为突出，可破坏肠道屏障完整性、引发炎症反应，但具体的分子机制尚未完全阐明，这限制了有效干预策略的开发。与此同时，作为一种强大的脂溶性类胡萝卜素抗氧化剂，番茄红素（LYC）在番茄等红色蔬果中含量丰富，因其卓越的自由基清除和抗氧化能力，在维持肠道稳态方面展现出巨大潜力。然而，LYC如何拮抗DON诱导的肠道损伤，其深层机制仍有待探索。为此，研究人员在《Research》期刊上发表了这项研究，旨在深入揭示LYC的保护作用及其背后的分子通路。
研究人员运用了包括RNA测序（RNA-seq）、蛋白质印迹（Western blot）、免疫荧光（IF）、SA-β-gal衰老染色、EdU细胞增殖检测、流式细胞术细胞周期分析、细胞热位移分析（CETSA）、分子对接与分子动力学模拟以及过表达载体转染和NLRP3抑制剂（MCC950）干预在内的多种关键技术方法。研究所用的细胞模型为源自新生仔猪的猪肠道上皮细胞系（IPEC-J2细胞），该模型是研究肠道功能的常用体外模型。
LYC alleviated the DON-induced inflammatory response in IPEC-J2 cells
研究人员首先通过RNA测序分析发现，DON处理显著改变了IPEC-J2细胞的基因表达谱，而LYC共处理可逆转这些变化。京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析显示，DON处理主要影响了TNF信号通路、Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路和趋化因子信号通路。蛋白质水平检测证实，DON显著上调了TLR4、MyD88、TNF-α、IL-6、p-NF-κB和p-IκB等炎症相关蛋白的表达，而LYC处理有效抑制了这些蛋白的上调。免疫荧光分析也观察到LYC降低了DON诱导的p-IκB荧光信号增强。这些结果表明，LYC通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB等促炎信号通路的激活，减轻了DON诱导的炎症反应。
LYC attenuated DON-induced cellular senescence in the IPEC-J2 cells
KEGG和基因集富集分析（GSEA）均提示细胞衰老和细胞周期通路在DON处理后发生显著变化。进一步实验证实，DON暴露导致细胞增殖标志物Ki-67表达下降，而衰老相关标志物P21、P16、P53和DNA损伤标志物γ-H2AX表达上调，LYC处理则有效阻断了这些变化。SA-β-gal染色显示DON增加了衰老阳性细胞的比例，LYC可抑制此现象。EdU实验表明DON抑制了DNA合成和细胞增殖，LYC恢复了细胞的增殖能力。流式细胞术分析发现DON引起了明显的G2期细胞周期阻滞，而LYC处理使其恢复正常。这些发现证明LYC能有效缓解DON诱导的细胞衰老，恢复细胞正常增殖能力。
LYC attenuated DON-induced pyroptosis and up-regulation of TXNIP protein in the IPEC-J2 cells
研究人员评估了细胞焦亡（一种程序性细胞死亡）相关指标。Western blot结果显示，DON显著提高了NLRP3、Caspase-1、IL-1β、GSDMD-N和硫氧还蛋白相互作用蛋白（TXNIP）的蛋白水平，LYC处理则有效缓解了这些升高。免疫荧光分析也观察到LYC降低了DON引起的NLRP3荧光强度增强。相关性分析和蛋白互作网络图揭示了焦亡与细胞衰老之间的紧密联系。为探究DON是否直接靶向TXNIP，研究人员进行了分子对接和分子动力学模拟，结果表明DON能与TXNIP稳定结合。细胞热位移实验进一步证实，DON处理增强了TXNIP蛋白的热稳定性，支持了二者的直接相互作用。这些结果提示，LYC可能通过抑制TXNIP介导的焦亡来恢复细胞状态。
TXNIP overexpression counteracted the protective effects of LYC on DON-induced inflammatory response and pyroptosis
为了探究TXNIP在LYC缓解DON诱导的肠道损伤中的作用，研究人员在IPEC-J2细胞中过表达了TXNIP。结果显示，TXNIP过表达显著逆转了LYC对DON诱导的炎症相关蛋白（TLR4, MyD88, TNF-α, IL-6, p-NF-κB, p-IκB）以及焦亡相关蛋白（NLRP3, IL-1β, Caspase-1, GSDMD-N, TXNIP）表达上调的抑制作用。免疫荧光分析也观察到，在TXNIP过表达情况下，LYC无法有效降低p-IκB和NLRP3的荧光信号。主成分分析进一步证明TXNIP过表达损害了LYC的恢复作用。这些发现表明，TXNIP过表达削弱了LYC在DON暴露的IPEC-J2细胞中的抗炎和抗焦亡作用。
TXNIP overexpression attenuated the protective effects of LYC against DON-induced cellular senescence
研究人员进一步检验了TXNIP过表达是否影响LYC对DON诱导的细胞衰老的拮抗作用。Western blot显示，TXNIP过表达显著上调了LYC与DON共处理组中P16、P21、P53和γ-H2AX的表达，同时降低了Ki-67的水平。免疫荧光分析也观察到γ-H2AX、P16和P53的核积累增强，以及Ki-67荧光减弱。SA-β-gal染色显示TXNIP过表达增加了衰老阳性细胞的比例。此外，TXNIP过表达还消除了LYC对DON诱导的细胞增殖抑制的拮抗作用，并逆转了LYC介导的对DON诱导的细胞周期阻滞的缓解。这些结果证明，TXNIP过表达削弱了LYC对DON诱导的细胞衰老的保护作用。
LYC relieved DON-induced senescence by inhibiting TXNIP-mediated NLRP3 inflammasome activation
TXNIP可通过与NLRP3炎症小体相互作用激活TXNIP/NLRP3通路从而诱导焦亡。为评估TXNIP–NLRP3炎症小体在LYC拮抗DON诱导的肠道上皮损伤中的作用，研究人员使用了NLRP3抑制剂MCC950进行验证。结果显示，MCC950处理逆转了由TXNIP过表达引起的Ki-67、P16、P21、P53和γH2AX蛋白表达变化。此外，MCC950处理降低了SA-β-gal阳性染色细胞的比例，增加了EdU标记细胞的荧光强度，并抑制了G2期阻滞，恢复了正常的细胞周期分布。相关性分析和蛋白互作网络图进一步表明了TXNIP、NLRP3、焦亡和细胞衰老之间的相互作用。这些结果表明，LYC通过抑制TXNIP介导的NLRP3炎症小体激活来缓解DON诱导的衰老。
综上所述，本研究的结论与讨论部分指出，DON作为一种常见的谷物污染物，严重威胁肠道健康。本研究证明，LYC能够缓解DON引起的猪肠道上皮细胞（IPEC-J2）结构损伤和功能障碍，包括抑制细胞增殖、诱导细胞周期停滞和加速细胞衰老。其机制在于，LYC通过抑制TLR4/NF-κB/TNF-α通路减轻了炎症反应，并通过阻止DON引起的TXNIP蛋白表达上调和NLRP3炎症小体依赖性细胞焦亡，从而延缓细胞衰老。关键的机制验证实验发现，过表达TXNIP会逆转LYC对DON诱导的焦亡和细胞衰老的拮抗作用，而使用NLRP3抑制剂MCC950则能恢复这些损伤。这清晰地表明，LYC通过靶向TXNIP，抑制其介导的NLRP3炎症小体激活，进而拮抗DON诱导的肠道上皮细胞衰老。这项研究的重要意义在于，首次将TXNIP确立为DON诱导肠道损伤的关键介质，它通过促进NLRP3驱动的焦亡和衰老发挥作用。研究发现，一种炎症蛋白TXNIP在连接衰老与NLRP3炎症小体介导的焦亡之间扮演了核心角色，这为预防和治疗由霉菌毒素或其他因素引发的肠道疾病提供了新的潜在靶点和干预思路。尽管本研究主要在体外细胞模型中进行，未来需要体内实验进一步验证，但它为开发基于TXNIP-NLRP3轴的新型肠道保护策略奠定了重要的理论基础。
