《Research》：Environmental Fluoride Compromises Male Fertility: Differentially Modulated miR-34a-5p Targets REST to Regulate Autophagy in Testicular Somatic Cells
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本研究针对环境氟化物暴露导致雄性生育力下降这一重大公共卫生问题，研究人员聚焦于睾丸体细胞（Leydig细胞与Sertoli细胞）自噬失衡的分子机制。他们发现氟化物通过差异调控关键miRNA——miR-34a-5p，进而靶向转录因子REST，在Leydig细胞中促进自噬，而在Sertoli细胞中抑制自噬，从而揭示了氟化物雄性生殖毒性的新机制，为相关疾病的干预提供了潜在靶点。该成果发表于《Research》期刊。
全球范围内男性生育力的下降正成为一个日益严峻的公共卫生挑战，而环境氟化物暴露被认为是加剧这一趋势的关键因素。氟化物作为一种普遍存在的环境污染物，通过饮用水等途径进入人体并产生生物累积，其对男性生殖系统的毒性作用已引起广泛关注，但其具体作用机制尚不完全清楚。睾丸中的体细胞，包括负责合成睾酮的Leydig细胞和支持精子发生的Sertoli细胞，对于维持正常的睾丸结构和功能至关重要。自噬（Autophagy）作为细胞内部清理受损组分、维持稳态的重要过程，在毒理学和生殖生物学中扮演着关键角色。有趣的是，现有研究表明氟化物对这两种睾丸体细胞的自噬活动产生了截然不同的影响：在Leydig细胞中促进自噬，而在Sertoli细胞中抑制自噬。这种差异调控背后的分子开关是什么？为了回答这个问题，研究人员展开了深入探索。
为了阐明氟化物如何差异调控睾丸体细胞自噬及其在雄性生殖毒性中的作用，研究人员综合运用了体内动物模型和体外细胞模型。他们首先建立了氟化物暴露的雄性小鼠模型，并通过组织病理学分析、精子质量评估以及透射电子显微镜观察，证实了氟化物确实损害了睾丸结构、降低了精子质量，并且差异性地改变了Leydig细胞和Sertoli细胞中的自噬体数量。随后，他们利用网络毒理学分析和功能验证，筛选并确认了miR-34a-5p是调控这一过程的关键分子。通过双荧光素酶报告基因实验、基因过表达和敲低等技术，他们进一步鉴定出转录因子REST是miR-34a-5p的新靶基因，并阐明了miR-34a-5p/REST轴在调节自噬和相关基因表达中的功能。最后，通过救援实验，验证了氟化物通过该通路差异调控自噬的具体机制。
氟化物通过差异调节睾丸体细胞自噬损害雄性生殖能力
研究人员通过给小鼠饮用含氟化物的水，成功模拟了环境氟暴露。结果显示，氟化物暴露导致小鼠睾丸生精小管结构紊乱，生精细胞层数减少，管腔内精子密度下降，并且精子畸形率显著升高，表明雄性生殖能力受损。在细胞水平上，透射电镜观察发现，氟化物暴露后Leydig细胞中自噬体数量增加，而Sertoli细胞中自噬体数量减少。免疫组化和蛋白质印迹（Western blot）分析进一步证实，在Leydig细胞中，自噬标志蛋白LC3B-II/LC3B-I的比值升高，而自噬底物p62的蛋白水平在低中浓度氟化物处理下降低，但在高浓度下升高，提示高浓度氟化物可能阻碍了自噬流的降解阶段。相反，在Sertoli细胞中，LC3B-II/LC3B-I比值和p62蛋白水平均呈剂量依赖性下降。通过使用自噬抑制剂氯喹（Chloroquine）进行干预实验，研究人员确定氟化物在Sertoli细胞中主要是抑制了自噬体的形成，而非降解过程。细胞活力实验表明，无论是过度的自噬（如氟化物处理的Leydig细胞）还是受抑制的自噬（如氟化物处理的Sertoli细胞），都对细胞存活有害。这些结果清晰地表明，氟化物通过差异调节睾丸体细胞的自噬，损害了雄性生殖能力。
miR-34a-5p被鉴定为氟化物差异调节睾丸体细胞自噬的关键miRNA
为了寻找调控自噬差异的关键分子，研究人员进行了生物信息学分析，从多个数据库交叉比对后筛选出9个候选miRNA，其中miR-34a-5p的相关性评分最高。qRT-PCR检测发现，在氟化物处理的TM3 Leydig细胞中，miR-34a-5p的表达下调；而在TM4 Sertoli细胞中，其表达上调。睾丸组织的荧光原位杂交（FISH）结果也验证了这一相反的调控模式。这表明miR-34a-5p是介导氟化物在两种细胞中产生相反自噬效应的关键miRNA。
氟化物差异调节miR-34a-5p以调控睾丸体细胞自噬
为了验证miR-34a-5p的功能，研究人员在睾丸体细胞中进行了miR-34a-5p的过表达和敲低实验。结果表明，过表达miR-34a-5p能够抑制自噬（表现为LC3B-II/LC3B-I比值和p62蛋白水平下降），而敲低miR-34a-5p则促进自噬。更重要的是，救援实验显示，在氟化物处理的Leydig细胞中过表达miR-34a-5p，可以逆转氟化物引起的自噬增强；而在氟化物处理的Sertoli细胞中敲低miR-34a-5p，则可以逆转氟化物引起的自噬抑制。这直接证明了氟化物通过下调miR-34a-5p促进Leydig细胞自噬，通过上调miR-34a-5p抑制Sertoli细胞自噬。
miR-34a-5p在氟化物暴露的睾丸体细胞中靶向REST
研究人员注意到，在自噬受抑制的Sertoli细胞中，p62的蛋白水平也下降，这提示可能存在转录水平的调控。他们发现p62的mRNA表达也受到氟化物和miR-34a-5p的调节。通过生物信息学预测和实验验证，他们筛选出转录因子REST是miR-34a-5p的潜在靶标。双荧光素酶报告基因实验证实，miR-34a-5p能够直接结合REST基因的3'非翻译区（3' UTR）并抑制其表达。FISH实验显示miR-34a-5p与Rest mRNA在睾丸体细胞中共定位。Western blot结果进一步表明，miR-34a-5p过表达会降低REST蛋白水平，而敲低miR-34a-5p则会升高REST蛋白水平。因此，REST被确认为miR-34a-5p的新靶基因。
miR-34a-5p通过靶向REST调节睾丸体细胞自噬
接下来，研究人员探讨了REST本身对自噬的调控作用。发现在睾丸体细胞中敲低REST会抑制自噬，而过表达REST则会促进自噬，表明REST具有促进自噬的功能。救援实验表明，在过表达miR-34a-5p的细胞中同时过表达REST，可以逆转miR-34a-5p对自噬的抑制作用，并且能挽救p62 mRNA表达的下调。这证明miR-34a-5p确实是通过靶向REST来调控自噬和p62的转录。
氟化物差异调节REST以调控睾丸体细胞自噬
最后，研究人员验证了氟化物是否通过REST来调控自噬。免疫荧光和Western blot结果显示，氟化物处理使Leydig细胞中REST的表达上调，而使Sertoli细胞中REST的表达下调。救援实验证实，在氟化物处理的Leydig细胞中敲低REST，可以逆转氟化物引起的自噬增强；而在氟化物处理的Sertoli细胞中过表达REST，则可以逆转氟化物引起的自噬抑制。这最终阐明了氟化物→miR-34a-5p→REST→自噬的完整调控通路在两种睾丸体细胞中的差异作用模式。
本研究揭示了环境氟化物损害雄性生育力的一个新机制。核心发现在于，氟化物通过差异调控同一个关键分子miR-34a-5p，在睾丸的两种重要体细胞——Leydig细胞和Sertoli细胞中，对自噬产生了截然相反的效应。在Leydig细胞中，氟化物下调miR-34a-5p，解除了其对靶基因REST的抑制，导致REST表达升高，进而促进自噬，而过度的自噬最终损害了细胞活力。在Sertoli细胞中，情况正好相反，氟化物上调miR-34a-5p，增强了其对REST的抑制，导致REST表达下降，从而抑制了自噬，自噬不足同样对细胞存活不利。这条新发现的miR-34a-5p/REST信号轴，为理解氟化物雄性生殖毒性的细胞特异性提供了分子基础。该研究不仅深化了对环境污染物生殖毒性机制的认识，而且提示miR-34a-5p和REST可能成为干预氟相关男性生殖健康问题的潜在靶点，具有重要的理论价值和潜在的临床应用前景。
