《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》：Identification of the cannabinoid receptor 1 antagonist, ibipinabant, as a potent inhibitor of Neisseria gonorrhoeae
ABSTRACT
淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）作为全球第二大细菌性性传播疾病的病原体，已被列为紧迫的公共卫生威胁和高优先级病原体。令人担忧的是，淋病奈瑟菌已对几乎所有FDA批准的药物产生耐药性。目前，尚无批准的口服疗法，注射用头孢曲松是FDA批准的唯一用于治疗多重耐药淋球菌感染的方案。然而，头孢曲松耐药菌株已在全球范围内被发现，这进一步凸显了开发新型抗菌药物的迫切性。
在一项针对2528个靶向G蛋白偶联受体（GPCR）及相关信号通路的小分子筛选中，强效大麻素受体1（CB1）拮抗剂伊比那班（ibipinabant）被鉴定出具有最强的抗淋球菌活性。伊比那班对20株淋病奈瑟菌分离株均表现出强效活性，且不抑制阴道微生物组中的一些代表性乳酸杆菌（Lactobacillus）物种。时间杀菌试验显示，伊比那班是杀菌性的，能在12小时内清除淋病奈瑟菌的负荷（低于检测限）。伊比那班清除人宫颈内膜细胞内淋病奈瑟菌负荷的能力也比首选药物头孢曲松更有效。该药物对多种细胞系无毒性，且不引起人红细胞溶血。最后，在淋病奈瑟菌生殖道感染的体内小鼠模型中，伊比那班治疗2天后淋球菌负荷显著降低（>95%）。总之，这些结果表明伊比那班是一种有前景的药物重定位候选物，可作为对抗多重耐药淋病奈瑟菌的新型抗菌剂。
INTRODUCTION
淋病奈瑟菌是性传播感染（STI）淋病的病原体，仍然是一个重大的全球公共卫生问题，全球病例超过8000万，其中仅美国就有150万例。淋病奈瑟菌可引起多种严重后遗症，导致女性和男性出现盆腔炎、异位妊娠和不孕等并发症。此外，淋病奈瑟菌感染可导致危及生命的并发症，包括心内膜炎、脑膜炎以及对人类免疫缺陷病毒（HIV）或其他性传播疾病的易感性增加。令人担忧的是，淋病奈瑟菌已对所有现有抗生素产生耐药性，使得肌肉注射头孢曲松成为唯一可用的FDA批准治疗方案，且头孢曲松耐药菌株现已在全球发现。更复杂的问题是，由于高成本、高风险和低经济回报，许多制药公司不再考虑投资新型抗菌药物的开发。因此，对无药可治的淋病时代的恐惧呼唤着迫切需要开发和发现新的疗法来治疗多重耐药淋球菌感染。
新药发现（De novo drug discovery）耗时且昂贵，平均需要10年时间，可能耗资超过10亿美元。药物重定位（drug repurposing）是寻找新疗法的一种有效替代策略。药物重定位能够将现有药物用于其他疾病适应症，从而规避新药发现的艰巨过程。在这种情况下，其毒性和药理学特性比新合成化合物更明确。这一策略正变得越来越成功，大约30%的FDA批准药物和疫苗来自药物重定位。
采用药物重定位策略，我们筛选了一个包含2528个小分子（MedChemExpress, HY-L006）的化合物库，这些分子靶向G蛋白偶联受体（GPCRs）及相关信号通路，以评估其抑制淋病奈瑟菌生长的能力。该分子库包含FDA批准的药物、抑制各种GPCR通路组分的化合物以及处于临床前和临床试验阶段的药物。已有研究表明，一些组成肠道微生物群的细菌可以产生作为GPCR配体的小分子，从而调节人-微生物相互作用。此外，已知的GPCR抑制剂已显示出抗菌活性并能预防伯内特考克斯体（Coxiella burnettii）的细胞内存活。具有GPCR样结构的脂肽也显示出对大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抗菌活性。这促使我们测试GPCR抑制剂库的抗淋球菌活性。在这些分子中，伊比那班被鉴定为具有最强抗淋球菌活性的化合物。伊比那班，也称为SLV-319和BMS-64656，是一种强效的大麻素受体1（CB1）拮抗剂。CB1拮抗剂，包括伊比那班和利莫那班（rimonabant），已被评估用于治疗肥胖和II型糖尿病。这种效应与组织炎症上调引起的肠道微生物群变化有关，但与直接抗菌活性无关。CB1拮抗剂伊比那班和利莫那班此前未被报道具有抗菌活性。在本研究中，我们评估了伊比那班对20株临床分离的多重耐药淋病奈瑟菌的抗菌活性。我们还评估了其在人和牛血清白蛋白存在下的效力。此外，我们测试了该药物对健康阴道微生物群成员的活性，这些微生物群可以防止淋病奈瑟菌定植。测量了针对不同细胞系的体外细胞毒性。进一步探索了伊比那班的杀菌动力学、抗生素后效应（PAE）以及减少细胞内淋病奈瑟菌负荷的能力。最后，在淋病奈瑟菌生殖道感染的小鼠模型中评估了伊比那班的体内疗效。
RESULTS
Anti-gonococcal activity of ibipinabant
伊比那班在针对2528个靶向GPCRs的小分子筛选中被鉴定为最有效的先导化合物。测试了伊比那班对20株淋病奈瑟菌分离株的抗菌活性，包括多重耐药菌株和10株具有不同耐药谱及已知表型和遗传标记的WHO参考菌株。发现伊比那班对所有测试的淋病奈瑟菌菌株均有效，最小抑菌浓度（MICs）范围在0.03至1 μg/mL之间。它在浓度分别为0.125 μg/mL和0.5 μg/mL时抑制了50%（MIC50）和90%（MIC90）的测试菌株。值得注意的是，伊比那班的活性与标准护理药物头孢曲松相当，后者的MIC50为0.03 μg/mL，MIC90为0.25 μg/mL。此外，伊比那班显示出比阿奇霉素更低的MICs，阿奇霉素的MIC50为0.5 μg/mL，MIC90为8 μg/mL。头孢曲松和阿奇霉素的耐药折点分别为>0.125 μg/mL和≥0.5 μg/mL。此外，伊比那班对阿奇霉素和头孢曲松耐药菌株保持了活性，尽管其对头孢曲松耐药的WHO-X菌株的MIC最高，是个例外。
此外，为了研究伊比那班是否对其他革兰氏阴性菌有活性，我们测定了其对代表性细菌物种的MICs，如大肠杆菌、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、鼠伤寒沙门菌（Salmonella Typhimurium）以及甲氧西林敏感和耐药的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）菌株。该药物对测试的革兰氏阴性菌株无效（MICs > 64 μg/mL），但对一些非淋病奈瑟菌（non-gonorrhoeae Neisseria）物种有效。这表明其具有特异性的抗奈瑟菌活性。
Effect of ibipinabant and control antibiotics against representative Lactobacillus species of the vaginal microbiota
阴道微生物群可以干扰淋病奈瑟菌在泌尿生殖环境中的定植。因此，新的抗淋球菌疗法最好能抑制淋病奈瑟菌，同时对正常阴道微生物群的活性有限。因此，我们测试了伊比那班和作为对照的阿奇霉素对组成泌尿生殖道微生物群的代表性乳酸杆菌菌株的抗菌活性。伊比那班对任何测试的乳酸杆菌菌株均未显示出抑制作用（MICs >128 μg/mL）。相反，阿奇霉素强效抑制了所有测试的乳酸杆菌菌株的生长（MICs ≤1 μg/mL）。
Activity of ibipinabant in the presence of serum
高水平的血清结合会阻止药物以有效量到达感染部位，从而影响药物的体内效力。因此，我们评估了伊比那班在牛血清白蛋白（BSA）和人血清白蛋白（HSA）存在下的活性。当暴露于含有BSA或HSA（4%）的培养基时，伊比那班对淋病奈瑟菌WHO-X的MIC没有变化，对淋病奈瑟菌FA1090的MIC仅增加两倍（从0.031到0.063 μg/mL）。这种趋势在对照抗生素阿奇霉素上也观察到，阿奇霉素已被证明几乎没有或没有血清结合，而头孢曲松对WHO-X增加了八倍（从2到16 μg/mL），对FA1090增加了四倍（从0.002到0.008 μg/mL），这也是预期的。
Safety profile of ibipinabant
最初针对两种哺乳动物细胞系研究了伊比那班的细胞毒性：非洲绿猴肾上皮细胞（Vero）和人宫颈内膜细胞（ME-180）。当暴露浓度高达128 μg/mL时，对Vero和ME-180细胞均未显示毒性。所有细胞均保持存活。还使用人红细胞（RBCs）评估了伊比那班的溶血活性。伊比那班在浓度高达256 μg/mL时几乎未引起处理过的人红细胞溶血，强调了人类细胞对伊比那班的耐受性。
Killing kinetics of ibipinabant against N. gonorrhoeae
采用时间杀菌试验来确定伊比那班对淋病奈瑟菌的杀菌模式。伊比那班（5倍MIC）对淋病奈瑟菌FA1090表现出杀菌作用，在8小时后将细菌计数减少3 log10CFU/mL，并在12小时后将细菌负荷完全清除至检测限以下。对照抗生素头孢曲松在8小时后将细菌计数降至检测限以下，而阿奇霉素在6小时后减少细菌计数。
PAE of ibipinabant against N. gonorrhoeae
在确认伊比那班对淋病奈瑟菌的杀菌活性后，我们检测了伊比那班在短暂暴露后是否能表现出延长的抗淋球菌抑制活性。抗生素后效应（PAE）是指药物在短暂暴露后能够继续抑制细菌生长的时间段。这有助于确定给药方案。伊比那班对淋病奈瑟菌WHO-X表现出8小时的PAE。类似地，对照抗生素阿奇霉素也表现出8小时的PAE。
Intracellular clearance activity of ibipinabant
淋病奈瑟菌可以侵入上皮细胞并在细胞内存活，这可能导致播散性和持续性感染、子宫和输卵管感染，并最终导致不孕。由于伊比那班对细胞外细菌表现出强效抗淋球菌活性，我们有兴趣探索伊比那班消除已侵入阴道宫颈内膜细胞的淋病奈瑟菌的能力。因此，该药物在感染了淋病奈瑟菌WHO-X（头孢曲松耐药，阿奇霉素敏感）的ME-180细胞上进行了测试。使用庆大霉素保护试验，我们显示伊比那班（5倍MIC）能够清除细胞内淋病奈瑟菌的负荷（低于检测限），与阿奇霉素类似。然而，头孢曲松显示的CFU与阴性对照（DMSO）相似。
In vivo efficacy of ibipinabant in a murine gonococcal vaginal infection model
受伊比那班在体外对淋病奈瑟菌强效活性的启发，我们在雌性生殖道淋球菌感染小鼠模型中测试了其体内疗效。在这项研究中，雌性去势BALB/c小鼠在感染淋病奈瑟菌WHO-XrpsLA128G前两天皮下植入5毫克、21天控释雌二醇 pellets。该菌株对头孢曲松耐药，对阿奇霉素敏感。我们构建此菌株是为了将rpsl基因插入淋病奈瑟菌WHO-X的基因组中，以诱导链霉素耐药性，专门用于体内小鼠模型。小鼠口服伊比那班（20 mg/kg）连续两天。与载体对照组相比，伊比那班治疗组小鼠在治疗2天后淋病奈瑟菌负荷显著降低（>95%）。相比之下，单剂量头孢曲松（15 mg/kg，腹腔注射）治疗的小鼠未表现出淋病奈瑟菌负荷的显著降低。
DISCUSSION
淋球菌感染的高发病率以及抗生素耐药性的急剧发展构成了重大的公共卫生挑战。据报道，至少有九个国家的分离株对当前首选药物头孢曲松的耐药水平升高（范围从5%到40%）。几个综合因素导致了淋球菌感染的发生和治疗困难。例如，感染过程的各个阶段，粘膜粘附、粘膜侵袭、局部炎症反应和全身播散，都会影响针对该病原体的治疗靶向。此外，淋病奈瑟菌表面粘附素的高频抗原性和相变，加上对免疫系统效应物和调节因子的抑制，使该病原体能够逃避免疫系统，这增加了治疗难度。目前，尚未开发出有效的疫苗来预防淋病奈瑟菌感染。此外，新型抗菌药物的缺乏以及对当前使用抗生素的耐药性日益发展引起了严重关切。因此，开发能够靶向淋病奈瑟菌的新型抗菌药物至关重要。
药物重定位是一种为规避耗时且昂贵的传统新药发现过程而出现的策略。我们利用这一策略来识别治疗多重耐药淋病奈瑟菌感染的新候选药物。
伊比那班在针对2528个靶向GPCRs及相关信号通路的小分子筛选中被鉴定出具有强效的体外抗淋球菌活性。伊比那班是一种CB1抑制剂，与其他CB1抑制剂一起已被探索用于治疗肥胖、II型糖尿病以及减少食物和酒精过量摄入。CB1是A类GPCR，拥有典型的七次跨膜结构域（7TM）。GPCRs几乎只在真核生物中发现和研究。然而，最近的一项研究报告称，真核GPCRs可能是原核钠转运视紫红质（sodium-translocating rhodopsins）的后代。有趣的是，CB1是来自哺乳动物视紫红质超家族的A类GPCR。因此，我们假设淋病奈瑟菌可能具有与GPCR相关的受体和通路（特别是与CB1相关）。全面阐明伊比那班在淋病奈瑟菌中的靶点将是未来研究的主题。
在本研究中，伊比那班针对一组多重耐药淋病奈瑟菌临床分离株进行了评估。伊比那班强效抑制淋病奈瑟菌生长，MICs从0.03到1 μg/mL。伊比那班的MIC50和MIC90与头孢曲松相当，并且对头孢曲松耐药菌株表现出强效活性。此外，伊比那班比阿奇霉素更有效，对阿奇霉素耐药菌株保持了强效活性。对代表性革兰氏阴性或革兰氏阳性菌未显示出抗菌活性，表明其可能对奈瑟菌属具有选择性活性。
泌尿生殖道菌群失调会增强淋球菌的定植和感染。健康的微生物组可以提供许多益处，防止定植和感染的建立，并有助于抵抗正在进行的感染。阴道微生物群不仅可以在尿道上与淋病奈瑟菌竞争附着，还有助于创造酸性环境，从而抑制淋病奈瑟菌定植。包括当前淋球菌感染一线治疗方案（头孢曲松和阿奇霉素）在内的广谱抗菌素已知会破坏健康微生物组，这可能导致负面的治疗后结果。识别能够保护健康微生物群同时保持对淋病奈瑟菌选择性的疗法有助于获得更有利的临床结果。因此，我们评估了伊比那班对正常人类阴道微生物群代表性成员的活性。伊比那班显示对测试的乳酸杆菌物种无影响（MICs >128 μg/mL）。相反，与之前的报告一致，阿奇霉素对这些微生物群菌株表现出强效抑制活性。这些结果表明伊比那班作为抗淋球菌疗法具有潜在优势，可以选择性抑制致病性淋球菌而不破坏有益的阴道微生物群。
我们接下来评估了伊比那班的杀菌动力学。伊比那班表现出杀菌活性，在12小时内将高起始接种量的淋病奈瑟菌清除至检测限以下。这种杀菌活性是伊比那班作为淋病奈瑟菌潜在治疗剂的一个优势，因为具有杀菌活性的药物有几个优点，包括限制感染传播、可能减少细菌耐药性的出现以及缩短治疗持续时间，这对于多重耐药性传播感染（STIs）的依从性非常重要。
为了确定有效的给药方案，找出PAE是至关重要的一步。较长的PAE与较长的给药间隔相关，这对患者依从性很重要，尤其是对于性传播感染。此外，较长的给药间隔有助于因所需剂量减少而降低这些药物对患者的成本。在细菌暴露于5倍MIC 1小时后进行的PAE研究发现，伊比那班能够在暴露后8小时内抑制淋病奈瑟菌的生长，与对照药物阿奇霉素相当。
淋病奈瑟菌可以侵入上皮细胞并在细胞内存活，这可能导致播散性和持续性感染、子宫和输卵管感染，并最终导致不孕。标准护理药物头孢曲松不能有效清除细胞内淋球菌感染，原因有多种，包括其复杂庞大的结构、高亲水性和低主动转运。然而，像阿奇霉素这样的药物可以穿透细胞。因此，具有细胞内活性的新疗法很重要。伊比那班和阿奇霉素能够将ME-180细胞内的淋病奈瑟菌负荷清除至检测限以下，而头孢曲松无效。结果表明，伊比那班可能以显著降低细胞内淋病奈瑟菌的浓度进入宫颈内膜细胞，其效果优于当前首选药物头孢曲松。
最后，伊比那班的有前景的特性促使我们评估其在雌性小鼠阴道感染模型中对淋病奈瑟菌WHO-X（头孢曲松耐药）的体内疗效。我们之前使用本课题组开发的链霉素耐药淋病奈瑟菌WHO-X菌株建立了该小鼠模型。伊比那班口服治疗2天后能够将小鼠体内的淋病奈瑟菌CFU计数降低1 log10CFU/mL。这比首选药物头孢曲松有效得多。因此，伊比那班作为对抗多重耐药淋病奈瑟菌的治疗剂具有强大的临床成功潜力。
总之，在本研究中，我们报道了伊比那班在体外和体内对淋病奈瑟菌的选择性杀菌活性。我们的结果表明伊比那班有潜力作为一种新型抗淋球菌药物。有机会在未来的研究中进一步优化该化合物，以开发出更有效、更安全的类似物用于对抗淋病奈瑟菌。需要进一步研究伊比那班作为一种新型抗淋球菌药物，以明确阐明其抗菌作用机制。
MATERIALS AND METHODS
Bacterial strains, chemicals, and media
淋病奈瑟菌分离株和代表性革兰氏阴性菌株来自美国疾病控制与预防中心（CDC）和美国模式培养物集存库（ATCC），乳酸杆菌菌株来自生物防御与新发感染研究资源库（BEI Resources）。
化学品和培养基购自商业来源：GC琼脂基础、巧克力II琼脂、干燥牛血红蛋白、布鲁氏菌肉汤和IsoVitaleX（Becton, Dickinson and Company, Cockeysville, MD），心浸液琼脂（Hardy Diagnostics, Santa Maria, CA），酵母提取物和葡萄糖（Fisher Bioreagents, Fair Lawn, NJ），血红素、吡哆醛和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）（Chem-Impex International, Wood Dale, IL），蛋白胨和VCNT补充剂（Oxoid, Lenexa, KS），磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Corning, Manassas
