新月柄杆菌异源铁载体利用机制：hiuABC操纵子介导羟胺类铁载体摄取与铁代谢途径解析

《Journal of Bacteriology》：The hiuABC operon mediates xenosiderophore utilization in Caulobacter crescentus

本研究发现新月柄杆菌（Caulobacter crescentus）通过保守的hiuABC操纵子高效利用土壤微生物产生的羟胺类铁载体（如ferrioxamine B和ferrichrome）。研究通过条形码转座子筛选（RB-TnSeq）和遗传互补实验，揭示HiuA作为关键外膜转运蛋白（TBDT），而HiuB（PepSY结构域蛋白）与HiuC（内膜蛋白）形成复合物，在铁载体处理中发挥底物特异性调控作用。该机制为理解细菌在铁限制环境中的适应性进化提供了新视角。

　　

ABSTRACT

新月柄杆菌属（Caulobacter）作为土壤和水生生态系统的常见菌群，常面临生物可利用铁严重匮乏的环境压力。与其它双膜细菌类似，新月柄杆菌（Caulobacter crescentus）通过外膜TonB依赖性转运蛋白（TBDT）识别并导入铁结合型铁载体（ferric siderophore）以获取Fe(III)。尽管新月柄杆菌自身不合成铁载体，但其编码多个受铁摄取抑制蛋白（Fur）转录调控的TBDT，表明其通过窃取邻近微生物产生的异源铁载体（xenosiderophore）获取铁。为鉴定新月柄杆菌利用异源铁载体所需基因，本研究以放线菌产生的羟胺类铁载体ferrioxamine B（FXB）为模型底物，开发了条形码转座子筛选技术。该筛选发现了hiuABC——一个保守且受Fur调控的操纵子，其支持FXB依赖性铁摄取。实验证实hiuA编码负责摄取ferrioxamine和ferrichrome（FC）的主要TBDT，二者是羟胺类铁载体家族中结构迥异的成员。hiuB编码的PepSY结构域蛋白与铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的FoxB（一种已知周质铁载体还原酶）具有结构相似性。hiuC编码一个预测与HiuB在内膜形成功能复合体的小型假设膜蛋白。hiuB和hiuC均为利用FXB和ferrioxamine E（FXE）所必需，表明二者在ferrioxamine铁摄取中具有共同作用。意外的是，FC作为铁源的利用需要hiuB而非hiuC，提示HiuC在铁载体处理中发挥底物特异性作用。结论认为，保守的hiuABC操纵子编码的蛋白组合使细菌能够从结构多样的羟胺类铁载体中获取铁。

INTRODUCTION

铁作为几乎所有生物必需的营养因子，在细胞呼吸、DNA修复和气体感应等关键生物过程中作为辅因子发挥作用。尽管铁是地壳中含量最丰富的元素之一，但在有氧环境中，中性pH条件下Fe(III)形成难溶性氢氧化物和氧化物，使其常成为限制性营养素。好氧土壤和水中生物可利用Fe(III)浓度在pH 7时可低至10^?18M，远低于微生物生长所需浓度。在此条件下，微生物常通过分泌铁载体——一种高亲和力Fe(III)螯合分子，从矿物或有机复合物中溶解铁——从环境中获取铁。目前已鉴定超过500种铁载体，分布于不同生态位。

双膜细菌因具有双层膜细胞包膜而面临铁摄取的额外挑战。铁载体等有机铁复合物通常因分子过大或浓度过低而无法依赖被动扩散穿过细胞包膜。为主动获取铁，双膜菌采用TBDT——一类专门的外膜β-桶状受体，可结合并转运多种底物，包括铁-铁载体复合物。TBDT对特定结构类别的铁载体（如儿茶酚盐、羟胺盐或羟基羧酸盐）表现出特异性。铁载体结合后，TBDT发生构象变化暴露其TonB盒，从而与锚定在内膜的TonB蛋白结合。TonB由ExbB–ExbD复合物提供的质子动力驱动，并通过构象重排促使铁-铁载体通过TBDT进入周质。进入周质后，铁-铁载体可在局部被还原，或递交给ABC转运蛋白转运至细胞质。

新月柄杆菌属是代谢多样的好氧双膜菌，常见于陆地和水生生态系统，并被确定为植物微生物群落中的枢纽物种。其模式菌株新月柄杆菌缺乏已知的铁载体生物合成基因，但编码62个预测的TBDT。这表明该菌具有识别和导入其他微生物产生的多种异源铁载体的能力。事实上，铁限制已知可解除新月柄杆菌中四个Fur调控TBDT基因（cciT、CCNA_00138、hutA和CCNA_03023）的转录抑制。其中hutA编码已表征的血红素/血红素转运蛋白，而cciT、CCNA_00138和CCNA_03023（后文称为hiuA）的底物仍未确定。

羟胺类铁载体，包括线性三羟胺ferrioxamine B（FXB）和环状六肽ferrichrome（FC），在陆地生态系统中常见，并能促进新月柄杆菌在铁限制条件下的生长。然而，介导其摄取的具体TBDT仍未确定。此外，在这种重要的模式细菌中，铁-铁载体复合物在周质中的命运研究甚少。为解决这些知识空白，本研究开发了一种基于肉汤的遗传筛选平台，用于分析新月柄杆菌的铁载体获取机制。本文报告了一种全基因组方法，利用条形码转座子突变体文库鉴定新月柄杆菌中羟胺类铁载体获取基因。基于先前研究表明复杂培养基的EDTA处理可诱导铁饥饿，而铁-铁载体补充可恢复生长，我们以FXB作为模型外源铁源进行筛选。该方法发现了一个受Fur调控的三基因羟胺铁摄取操纵子（hiuA、hiuB和hiuC），其支持利用土壤和水生环境中常见的结构不同的羟胺型铁-铁载体。本文描述了hiu操纵子产物的功能和结构分析。

RESULTS

Desferrioxamine限制细胞内铁并抑制新月柄杆菌生长，而FXB在铁限制条件下促进生长

实验首先测试了1 μM desferrioxamine B（FXB的无铁形式）是否抑制野生型（WT）新月柄杆菌在蛋白胨酵母提取物（PYE）复杂肉汤中的生长。Desferrioxamine B以极高的亲和力结合Fe(III)，因此会螯合并可能隔离生长培养基中的铁。将含1 μM desferrioxamine B的生长情况与含300 μM EDTA（一种已知通过降低细胞内铁可用性来限制新月柄杆菌生长的阳离子螯合剂）的情况进行比较。实验室制备的PYE肉汤含约700 nM铁，因此本实验中使用的desferrioxamine浓度超过了培养基中的可用铁。与普通PYE或补充300 μM EDTA的PYE相比，新月柄杆菌培养物的生长产量（以OD₆₆₀衡量）在desferrioxamine B存在下降低。这表明（i）desferrioxamine B是比EDTA更有效的新月柄杆菌生长抑制剂；（ii）在测试浓度下，铁负载形式的铁载体FXB未被有效导入。

预测desferrioxamine B的生长抑制与细胞内铁限制相关。为验证此点，测量了四个Fur调控启动子（P_feoAB、P_cciT、P_hutA和P_{CCNA_03023}）与荧光报告基因mNeonGreen融合后的转录情况。与未处理培养基相比，含1 μM desferrioxamine B的培养基中这些Fur调控启动子的转录显著更高，证明该浓度的desferrioxamine B降低了细胞质中的可用铁，从而通过铁限制减弱新月柄杆菌生长。此外，每个启动子在1 μM desferrioxamine B存在下的活性均显著高于300 μM EDTA条件，表明1 μM desferrioxamine B比300 μM EDTA施加了更强的铁限制。

最后，测试了将1 μM FXB（desferrioxamine B的铁结合形式）添加到EDTA处理生长培养基中是否减轻300 μM EDTA的生长限制效应。FXB结合Fe(III)的亲和力比EDTA高5-6个数量级，因此预计即使在300倍摩尔过量的EDTA存在下也能保留Fe(III)。与仅含EDTA的肉汤相比，WT菌株的生长在FXB补充下得到显著改善，尽管效果有限。下文提供了这种生长增强效应是由于从FXB获取铁的证据。

CCNA_03023-21操纵子（hiuABC）在从FXB获取铁中的作用

观察到1 μM铁-铁载体FXB在EDTA介导的铁限制下增强生长，促使我们研究FXB依赖性铁摄取的遗传基础。为此，我们采用随机条形码转座子测序（RB-TnSeq），在补充300 μM EDTA（含或不含1 μM FXB）的PYE肉汤中培养新月柄杆菌转座子突变体文库。由于FXB在EDTA处理肉汤中仅带来轻微的生长拯救，我们在此实验中连续传代培养，以放大与特定转座子插入相关的适应性缺陷（可能还有优势）。该方法产生了似乎存在FXB铁摄取缺陷的突变株。

检查突变株适应性值发现不同的突变类别。与预期一致，大多数突变体在任何处理条件下均未检测到适应性差异，而其他突变体在EDTA处理和EDTA + FXB补充培养基中表现出相似的适应性受损。我们还观察到不同处理间几种显著的适应性模式。在未处理的PYE中，缺陷于holdfast合成和附着的突变体表现出更高的表观适应性，因为它们仍富集于整体培养物中而非附着于培养孔壁。这种效应在EDTA中放大，并在添加FXB后部分逆转，提示holdfast介导的表面粘附与铁可用性之间存在联系。选择性血红素和血红素蛋白生物合成基因的破坏导致在未处理培养基中出现适度的适应性缺陷，在EDTA中无影响，而在补充FXB的EDTA中赋予轻微的适应性优势。相比之下，选择性鞘脂生物合成基因的破坏在所有三种条件下均导致适应性缺陷，仅在添加FXB到EDTA后略有减弱。筛选中最显著的突变体是那些特异性在FXB补充条件下出现适应性缺陷而非仅在EDTA中的菌株，包括在CCNA_00973（蛋白酪氨酸磷酸酶）、CCNA_03022（PepSY家族内膜蛋白）、CCNA_03023（TonB依赖性外膜转运蛋白，TBDT）和CCNA_03277（糖基转移酶）中具有插入的菌株。

为优先选择进一步分析的候选基因，我们检查了FXB补充条件下突变体适应性值相关的t值。t值反映了特定基因适应性值的统计置信度。CCNA_03022和CCNA_03023突变体具有最高的t值（t > |10|），表明携带这些基因插入的菌株在此条件下存在一致且显著的生长缺陷。CCNA_03023编码一个与大肠杆菌（Escherichia coli）FhuA相关的TBDT，后者是已知介导铁-羟胺铁载体摄取的转运蛋白。CCNA_03022编码一个预测的PepSY-PiuB超家族内膜蛋白。这两个基因与CCNA_03021（编码一个预测的61个残基的假设内膜蛋白）组成一个受Fur调控的操纵子。CCNA_03021未在我们的RB-TnSeq筛选中被识别，因为它仅包含一个TnHimar插入位点，尽管该基因与CCNA_03022和CCNA_03023在变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidota）中同线性，提示其在从FXB获取铁中具有共同功能作用。我们此后将这些基因称为羟胺铁摄取A至C：hiuA（基因位点CCNA_03023）、hiuB（基因位点CCNA_03022）和hiuC（基因位点CCNA_03021）。

HiuA是FXB摄取的主要TBDT，其功能需要HiuB和HiuC

为测试hiuA是否编码FXB摄取的主要TBDT，我们使用了一组菌株，其中四个Fur调控TBDT中的三个已被删除。每个菌株仅保留四个Fur调控外膜转运蛋白中的一个：HiuA、CciT、CCNA_00138或HutA。在含300 μM EDTA的PYE培养基中，除??? cciT⁺菌株外，所有菌株的生长均被抑制。添加1 μM FXB对WT和??? cciT⁺菌株的生长仅有边际影响。??? 138⁺和??? hutA⁺菌株在EDTA存在下仍生长缺陷，但表现出轻微的FXB依赖性生长增强。相比之下，??? hiuA⁺菌株在添加1 μM FXB后生长增加了约200%。这些结果表明HiuA是新月柄杆菌中FXB摄取的主要外膜转运蛋白。

为解析hiuABC操纵子中其他基因的作用，我们在??? hiuA⁺背景中构建了hiuB和hiuC的框内缺失，生成??? hiuA⁺ΔhiuB和??? hiuA⁺ΔhiuC菌株。缺乏所有四个Fur调控TBDT的菌株（ΔΔΔΔ）作为阴性对照。在EDTA和FXB补充培养基中生长时，??? hiuA⁺菌株再次表现出强劲的FXB刺激生长，而ΔΔΔΔ、??? hiuA⁺ΔhiuB和??? hiuA⁺ΔhiuC菌株均未能对FXB产生响应。单独异位表达hiuC（由其天然hiuABC操纵子启动子驱动）可在??? hiuA⁺ΔhiuC菌株中恢复FXB依赖性生长，但从操纵子启动子单独异位表达hiuA或hiuB在相应缺失菌株中（分别为ΔΔΔΔ和??? hiuA⁺ΔhiuB）未能恢复FXB存在下的生长。然而，表达完整的hiuABC操纵子成功挽救了ΔΔΔΔ和??? hiuA⁺ΔhiuB菌株在FXB中的生长缺陷。值得注意的是，用完整的hiuABC操纵子互补??? hiuA⁺ΔhiuB使生长恢复至WT水平，高于亲本hiuA⁺背景；下文将讨论此点。

我们进一步构建了hiuB的cumate诱导型表达系统。与将hiuB直接融合到操纵子启动子的构建体相反，从质粒pPTM057-PQ5表达hiuB成功地将hiuA⁺ΔhiuB菌株的FXB依赖性生长恢复至与??? hiuA⁺亲本相当的水平。这一结果暗示从操纵子启动子（从单个染色体位点）人工驱动表达hiuB不足以实现互补，可能是由于表达水平欠佳。在hiuA⁺ΔhiuB背景中表达完整hiuABC操纵子观察到的生长增强可能反映了该菌株中存在hiuA的额外拷贝；HiuA水平可能在存在非最优底物（如FXB）时限制生长。

为理解这些互补结果，先前研究已鉴定出两个源自hiuA编码区内部的反义RNA，提示hiuABC操纵子受到转录后调控。支持这一点的是，核糖体图谱分析揭示了hiuA、hiuB和hiuC翻译效率的显著差异，表明复杂的转录后控制可能显著影响表达水平，并可能在单基因启动子融合构建体中被破坏。总之，我们的结果证明HiuABC系统是新月柄杆菌中主要的FXB转运系统，并且从FXB获取铁（通过HiuA转运）需要内膜蛋白HiuB和HiuC。当我们使用更高亲和力的HiuA底物（FC）时，观察到了不同的遗传互补结果，将在下文介绍。

内膜蛋白HiuB和HiuC支持FXB利用，且不依赖于外膜导入途径

ΔΔΔΔ菌株缺乏所有四个Fur调控TBDT（包括HiuA），但在补充1 μM FXB时表现出轻微的生长增强，提示存在替代的、低亲和力FXB获取机制。为验证此点，我们在PYE + 300 μM EDTA中培养WT、??? hiuA⁺和ΔΔΔΔ菌株，培养基补充了浓度递增的FXB（1–10 μM）。FXB以浓度依赖性方式增强所有菌株的生长，hiuA⁺菌株在3 μM FXB时达到WT样生长水平。ΔΔΔΔ菌株的生长如预期般受损，但仍随FXB增加而增强。我们得出结论，Fe(III)可以从FXB中通过不需要任何四个已知Fur调控TBDT的机制获取。

为测试内膜蛋白HiuB和HiuC是特异性与HiuA外膜转运蛋白协同作用，还是更广泛地 required for FXB utilization，我们测量了??? hiuA⁺或ΔΔΔΔ菌株（其中ΔhiuB或ΔhiuC被删除）在PYE + 300 μM EDTA补充10 μM FXB（即在ΔΔΔΔ菌株中产生最大生长增强的浓度）中的生长。??? hiuA⁺ΔhiuB和??? hiuA⁺ΔhiuC在此条件下均不生长。类似地，在ΔΔΔΔ背景中删除hiuB或hiuC均消除了在高FXB浓度下观察到的FXB依赖性生长增强。我们得出结论，hiuA提供了跨外膜最有效的FXB导入途径，但hiuB和hiuC是处理FXB中铁所必需的，无论外膜进入途径如何。

hiuABC操纵子支持从ferrioxamine E获取铁

由于hiuABC操纵子支持在EDTA螯合挑战期间的FXB依赖性生长增强，我们测试了其是否也支持从相关但结构不同的环状三羟胺铁载体ferrioxamine E（FXE）获取铁。在PYE肉汤 + 300 μM EDTA中补充1 μM FXE在16小时后并未增加培养密度，这表明新月柄杆菌要么缺乏有效的FXE摄取机制，要么根本无法从FXE获取铁。

为区分这两种可能性，我们将FXE浓度增加至10 μM。缺乏所有四个Fur调控TBDT的ΔΔΔΔ菌株在10 μM FXE下表现出适度的生长改善，而??? hiuA⁺菌株则表现出更显著的增长拯救。与FXB类似，FXE依赖性生长增强需要hiuB和hiuC。这些结果表明，从FXE获取铁（尽管效率低于FXB）也通过需要HiuB和HiuC内膜蛋白的机制进行。

HiuA和HiuB，而非HiuC，是FC利用所必需的

至此，我们已提供证据表明hiuABC操纵子促进从结构相关的三羟胺铁载体FXB和FXE获取铁。为测试hiuABC是否支持属于另一结构类别的羟胺铁载体的利用，我们测量了新月柄杆菌