《Journal of Virology》：Downmodulation of cholesterol biosynthetic network governs activation of the innate immune response to Japanese encephalitis virus infection
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本文通过脂质组学分析揭示，日本脑炎病毒（JEV）感染可导致宿主细胞脂质组广泛重编程，其中胆固醇生物合成通路的关键基因（如Dhcr7）呈现干扰素（IFN）依赖性的转录下调。研究进一步证实，通过基因敲低或药物抑制Dhcr7、或直接补充其底物7-脱氢胆固醇（7DHC），均可显著增强IRF3磷酸化与I型IFN信号，从而有效抑制JEV复制。该工作不仅阐明了胆固醇代谢与先天免疫在病毒感染中的交互调控机制，更为基于代谢重编程的抗病毒策略提供了新靶点。
脂质组学分析揭示JEV感染导致细胞脂质组广泛重编程
通过液相色谱-质谱（LC-MS）靶向脂质组学分析，研究人员对未感染（UI）和JEV感染（MOI=2，24小时）的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）进行了全细胞脂质组学表征。共鉴定出840种脂质物种，主要属于肉碱、甾醇、鞘脂、磷脂、甘油脂、神经酰胺、鞘磷脂和缩醛磷脂等类别。主成分分析（PCA）显示，JEV感染是细胞脂质谱变化的主要驱动力。火山图分析发现，JEV感染的MEFs中有346种脂质物种（占总数的41%）丰度发生显著改变，其中168种上调，178种下调。
主要变化体现在甾醇、鞘脂、磷脂、甘油脂和缩醛磷脂等类别中。具体而言，甾醇（胆固醇和胆固醇酯）、甘油脂（甘油三酯TG和甘油二酯DG）以及缩醛磷脂-甘油三酯（plasmanyl-TG）在感染后下调；而多种神经酰胺、磷脂（如溶血磷脂酰胆碱/磷脂酰胆碱LPC/PC、磷脂酰丝氨酸PS、磷脂酰肌醇PI、磷脂酰甘油PG）以及缩醛磷脂（除plasmanyl-TG外）则显著上调。比较未感染和感染条件下胆固醇、CE (20:4)、TG和DG的相对峰面积（与归一化脂质丰度相关）进一步证实了这些脂质水平的显著降低。
JEV感染与干扰素信号导胆固醇生物合成通路转录下调
先前研究已表明JEV感染可下调参与固醇和脂质生物合成的关键蛋白。本研究中，鉴于在病毒感染细胞中观察到胆固醇水平降低，研究人员进一步分析了胆固醇生物合成通路中几个关键基因的表达。结果显示，JEV感染的MEFs中，病毒RNA水平和滴度呈感染复数（MOI）依赖性增加，同时羟甲基戊二酰辅酶A还原酶（Hmgcr）、角鲨烯环氧酶（Sqle）、细胞色素P450 51A1（Cyp51A1）、跨膜7超家族成员2（Tm7sf2）、甲基固醇单加氧酶（Msmo）以及7-脱氢胆固醇还原酶（Dhcr7）的转录水平显著下调，其中Dhcr7的下调幅度最大，约50%。通过高灵敏度酶联免疫吸附试验（ELISA）检测，HMGCR和DHCR7的蛋白水平在感染细胞中也显著降低。该通路的主要转录因子固醇调节元件结合蛋白2（Srebp2）的转录水平虽未改变，但其前体和成熟形式蛋白分别在细胞质和核组分中减少，表明通路整体下调。
在骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）中，JEV感染或IFN-γ刺激也导致胆固醇生物合成通路基因的下调。类似地，登革病毒2型（DENV-2）感染的MEFs也显示出Hmgcr和Dhcr7的下调。用IFN-γ处理MEFs，或用聚肌胞苷酸（poly I:C）、脂多糖（LPS）、STING激动剂DMXAA刺激，同样引起了固醇生物合成基因的转录下调和HMGCR、DHCR7蛋白水平的降低，这表明该通路的下调可能是RNA病毒感染先天免疫感知相关的更广泛机制。
胆固醇生物合成通路的转录下调依赖于IFN信号
为探究JEV介导的固醇生物合成下调是否依赖于I型IFN信号，研究人员使用了来自野生型（WT）和I型、II型IFN受体敲除（IFN-α/β/γ R-/-）AG129小鼠的BMDMs。在缺乏IFN信号的AG129 BMDMs中，观察到病毒复制大幅增加，表明这些细胞对JEV感染的易感性增强。有趣的是，这些细胞中胆固醇代谢基因（Hmgcr、Sqle、Cyp51A1、Tm7sf2、Msmo、Dhcr7和Srebp2）的基础mRNA水平也显著更高，提示IFN信号与胆固醇生物合成通路之间存在负相关关系。比较JEV感染的WT和IFN-α/β/γ R-/-BMDMs中这些基因的表达水平发现，WT感染的BMDMs下调了胆固醇生物合成基因，而IFN-α/β/γ R-/-BMDMs的mRNA水平无明显变化。这表明JEV介导的胆固醇生物合成通路下调需要一个活跃的IFN信号网络。
敲低Dhcr7抑制JEV感染并增强IFN信号
由于Dhcr7基因在病毒感染细胞中下调幅度最大，研究人员深入探讨了其在JEV感染中的功能作用。通过siRNA靶向敲低MEFs中的Dhcr7，进一步抑制了JEV复制，表现为病毒RNA水平和滴度降低。Dhcr7敲低后，基础水平的IFNβ转录本增加，病毒感染细胞也显示出更高的IFNβ转录和分泌水平。与早期研究一致，Dhcr7敲低后IRF3磷酸化增强，表现为pIRF3/IRF3比率升高。这表明敲低Dhcr7可进一步下调JEV感染并增强干扰素信号。在Dhcr7沉默的细胞中也观察到了DENV-2感染的抑制。
药物抑制Dhcr7限制JEV感染并增强IFN信号
为评估抑制Dhcr7酶活性的影响，研究人员使用了其选择性抑制剂AY9944，该药物通过阻止7DHC转化为胆固醇来阻断胆固醇生物合成。AY9944处理显著抑制了JEV复制，其半数有效浓度（EC50）为1.22 μM。时间进程分析表明，AY9944不影响病毒感染的早期阶段（进入），而是在感染后6小时开始抑制病毒复制，同时负链RNA拷贝数相应减少。AY9944处理还激活了IRF3，并上调了IFNβ的转录和分泌水平。这表明，与敲低Dhcr7类似，药物抑制Dhcr7酶活性也能增强IFN激活并抑制病毒复制。另一种Dhcr7抑制剂他莫昔芬也观察到JEV复制减少。这两种药物对DENV-2复制也有显著抑制作用。
在BMDMs中，AY9944处理也显著抑制了病毒复制，并增强了IFNβ的转录和分泌水平以及IRF3磷酸化。为确定AY9944的抗病毒活性是否依赖于IFN信号，研究人员在IFN-α/β/γ R-/-BMDMs中测试了其效果。有趣的是，AY9944处理在IFN-α/β/γ R-/-BMDMs中也减少了病毒复制，但程度较WT BMDMs轻。这些数据表明，虽然增强IFN信号是Dhcr7抑制所观察效应的关键驱动因素，但一些不依赖于IFN的抗病毒效应也在起作用。
补充7-脱氢胆固醇发挥抗病毒作用
7DHC是Dhcr7基因的底物，在其被敲低或抑制后会积累。研究表明，与抑制Dhcr7类似，7DHC也能限制病毒感染并增加干扰素应答。外源性添加7DHC显著降低了病毒复制，表现为MEFs和BMDMs中JEV RNA水平和滴度降低。7DHC处理还显著增强了pIRF3水平，以及IFNβ的转录和分泌水平。在IFN-α/β/γ R-/-BMDMs中，补充7DHC对JEV复制有一定程度的抑制，这突出了调节Dhcr7存在不依赖于IFN的抗病毒效应。
Dhcr7抑制的抗病毒效应由7DHC积累介导
代谢物7-DHC在Dhcr7被敲低或抑制后积累。研究人员随后测试了补充Dhcr7酶活性上游或下游的代谢物是否会影响其抗病毒效应。为此，他们外源性添加了胆固醇（终产物）和甲羟戊酸（上游前体）。在模拟条件下，补充胆固醇显著降低了Dhcr7 mRNA水平，而补充甲羟戊酸则增强了其水平。在siNT JEV感染的细胞中，正如预期，Dhcr7 mRNA水平较低，补充胆固醇进一步降低了其水平，而补充甲羟戊酸则增强了其水平。siDhcr7处理在所有条件下都显著降低了mRNA水平。JEV感染期间补充胆固醇降低了siNT和siDhcr7处理细胞中的病毒复制。这与之前报道中补充或消耗胆固醇降低黄病毒复制的结果一致。相反，在siNT处理的细胞中补充甲羟戊酸通过上调包括Dhcr7在内的胆固醇生物合成通路基因增强了病毒复制。通过siRNA敲低Dhcr7能够在甲羟戊酸补充条件下抑制病毒复制，凸显了Dhcr7抑制的抗病毒潜力。AY9944处理也获得了类似结果。这些结果表明，下调或抑制Dhcr7对于发挥抗病毒效应至关重要。
讨论与总结
脂质代谢通路和宿主脂质在决定病毒致病性方面起着至关重要的作用，并常被病毒劫持以增强其复制。本研究通过脂质组学分析发现，JEV感染扰乱了宿主细胞近41%的脂质组，表现为胆固醇、胆固醇酯和甘油脂的下调，以及神经酰胺和多种磷脂的上调。伴随而来的是胆固醇生物合成通路基因的转录下调，其中Dhcr7的下调最为显著。
这种下调被证明依赖于活跃的干扰素信号网络。功能实验表明，无论是通过基因手段敲低Dhcr7，还是使用药物AY9944或他莫昔芬抑制其活性，亦或是直接补充其底物7DHC，都能显著激活IRF3磷酸化和I型IFN信号，从而有效抑制JEV的复制。尽管增强的IFN信号是抗病毒效应的主要驱动力，但在IFN信号缺陷的细胞中仍能观察到部分抗病毒效果，提示存在不依赖于IFN的机制。
此外，代谢物补充实验表明，Dhcr7抑制的抗病毒效应主要是通过其底物7DHC的积累介导的，而非单纯通过改变胆固醇水平。该研究揭示了一种新的机制，即JEV感染通过激活IFN信号，导致宿主胆固醇生物合成网络（尤其是Dhcr7）下调，而这种代谢重编程反过来又通过增强先天免疫应答来抑制病毒，形成了一个反馈调节环路。这为理解病毒与宿主代谢-免疫互作提供了新视角，并将胆固醇生物合成通路，特别是Dhcr7，定位为对抗JEV等黄病毒感染的潜在治疗靶点。
