《Microbiology Spectrum》：Gut microbiota and metabolomic changes across preterm stages: potential associations with bronchopulmonary dysplasia
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本文通过多组学整合分析，揭示了早产儿肠道菌群（如Bacteroidota）的时序性演变规律及其与支气管肺发育不良（BPD）的潜在关联，发现链球菌（Streptococcus）丰度与氧化应激标志物半胱氨酸（cysteic acid）呈正相关，为通过肠道微生物-代谢轴（gut-lung axis）早期干预BPD提供了新视角。
肠道菌群与代谢组在早产阶段的动态变化及其与支气管肺发育不良的潜在关联
分析微生物群落特征
研究通过Venn图分析揭示了不同胎龄阶段和临床条件下扩增子序列变异（ASV）的分布模式。早产（S1）和中产（S2）阶段分别检测到313和445个独特ASV，而晚产阶段（S3）的独特ASV数量显著增加至828个，表明随着胎龄成熟，微生物多样性显著增强。在疾病状态比较中，后续发展为支气管肺发育不良（BPD）的婴儿在出生24小时内（BPD1）的粪便样本中仅含有98个独特ASV，而非BPD婴儿（NBPD1）则含有159个独特ASV，提示临床状况对肠道微生物组成存在潜在影响。时间点间的比较进一步显示，非BPD婴儿的微生物动态变化更为显著，反映了其肠道微生物群落更为活跃的时序性演替。
肠道微生物群落丰度特征
在不同分类水平上对肠道微生物丰度进行分析，揭示了具有阶段特异性和疾病相关性的组成变化。在门水平上，变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteriota）在三个胎龄阶段（S1, S2, S3）均占据主导地位，占群落总量的75%以上。其中，变形菌门的相对丰度随着胎龄增长而显著增加，提示其在早期肠道发育中的关键作用。与之相反，拟杆菌门（Bacteroidota）则呈现显著下降趋势，从S1阶段的8.86%降至S3阶段的1.07%。在疾病状态下，这种下降更为剧烈：BPD1样本中拟杆菌门丰度仅为0.01%，远低于NBPD1样本的7.59%，表明拟杆菌门的早期定植可能与肠道健康维持密切相关。在纲水平上，微生物群落以γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、放线菌纲（Actinobacteria）、梭菌纲（Clostridia）和芽孢杆菌纲（Bacilli）为主。γ-变形菌纲持续为最优势类群，且其丰度随胎龄进展而逐步增加。相反，梭菌纲和拟杆菌纲（Bacteroidia）则显著下降，其中梭菌纲从S1的11.75%降至S3的7.06%。在疾病比较中，BPD1样本中的α-变形菌纲和放线菌纲较NBPD1更为富集，而非BPD婴儿则表现出更高的物种丰富度，反映了健康婴儿拥有更为多样和稳定的微生物群落。在目水平上，葡萄球菌目（Staphylococcales）在S3阶段急剧增加（S1: 0.44%, S2: 0.51%, S3: 9.99%），而肠杆菌目（Enterobacterales）和伯克霍尔德菌目（Burkholderiales）则随胎龄成熟逐渐增加。相反，乳杆菌目（Lactobacillales）、梭菌目（Clostridiales）和拟杆菌目（Bacteroidales）的丰度在各阶段均呈下降趋势。疾病组间比较显示，假单胞菌目（Pseudomonadales）、棒状杆菌目（Corynebacteriales）和柄杆菌目（Caulobacterales）在BPD1中更为丰富，而非BPD1中则富集了小杆菌目-新月菌目（Veillonellales-Selenomonadales）及未分类的“其他”类群。
为了探究BPD婴儿肠道微生物的时间动态变化，研究在出生后第28天收集了第二批粪便样本。结果显示，BPD婴儿中拟杆菌门的丰度出现了惊人的增长，从BPD1的0.01%上升至BPD2的23.29%，同时厚壁菌门的丰度也有所增加。相比之下，非BPD婴儿在出生时（NBPD1）拟杆菌门的丰度已达到7.59%。这表明非BPD婴儿的拟杆菌门定植发生得更早。因此，研究人员提出，拟杆菌门定植延迟可能作为BPD风险婴儿早期微生物失调的一个标志。
微生物群落多样性分析
α多样性分析（基于香农指数）显示，不同胎龄阶段之间以及BPD与非BPD组之间均无显著差异。同样，基于非度量多维标度（NMDS）的β多样性分析也未显示出按胎龄或疾病状态的统计学显著聚类，尽管在视觉上可以观察到微生物群落组成的细微变化。这些结果表明，在出生后早期发育过程中，整体微生物多样性保持相对稳定，且未因BPD而发生显著改变。然而，观察到的细微组成变化提示，在BPD的发病机制中，特定分类群水平的改变可能比广泛的多样性变化更为重要。
LEfSe分析与共现网络分析
线性判别分析效应大小（LEfSe）分析揭示了不同发育阶段（S1-S3）以及疾病状态（BPD1 vs NBPD1）之间肠道微生物组成的显著差异。在每个胎龄阶段都观察到了阶段特异性的微生物类群。在疾病比较中，多个类群在BPD1与NBPD1之间存在差异富集，提示了一种可能与疾病进展相关的菌群失调特征。
属水平的共现网络分析（基于前50个属）进一步阐释了微生物相互作用的动态变化。在早产（S1）和中产（S2）阶段，网络连接密集，表明微生物群落复杂且具有协作性。关键属如不动杆菌属（Acinetobacter）、短波单胞菌属（Brevundimonas）和假单胞菌属（Pseudomonas）在各个阶段均占据中心节点位置，凸显了它们在早产儿肠道中的核心生态作用。相比之下，S3阶段的网络显示出连接性降低和复杂性下降，这可能反映了微生物群落在成熟过程中的精简或生态系统稳定化。网络拓扑属性显示，从S1到S3，网络连接性逐渐降低，表现为密度（从0.292降至0.078）和平均度（从12.8降至2.7）的下降。相反，相对模块性增加（从0.278升至0.573），表明最初密集但结构松散的早期网络逐渐重组为更分明和稳定的模块。聚类系数也随时间下降，指示微生物关联变得冗余性更低、更具特异性。这些拓扑变化共同反映了出生后发育过程中肠道微生物群的生态稳定化。
跨胎龄阶段和BPD状态的代谢组学变化
为了增强统计稳健性，由于S2组样本量有限，研究将S1和S2组合并为早-中产组（S1 + S2），以便与晚产组（S3）进行更全面的比较。非靶向代谢组学分析在正负离子模式下均揭示了这两组之间不同的代谢特征。主成分分析（PCA）显示，在正负离子模式下，S1 + S2与S3组均存在明显分离，表明随着胎龄增长，整体代谢景观发生了显著改变。火山图分析在正离子模式下鉴定出175种显著改变的代谢物，其中在S3组中10种上调，165种下调。在负离子模式下，有103种代谢物差异表达，其中9种上调，94种下调。蝴蝶图展示了变化的幅度和方向，突出了代表性代谢物。在正离子模式下，包括IIE-Trp-Lys、1-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、N, N-二甲基鸟苷、Lewisγγγ四糖、D-木糖和β-D-葡萄糖在内的几种关键代谢物在S3组中显著降低，而半胱氨酸（cysteic acid）水平升高。在负离子模式下，观察到（3-苯丙酰）甘氨酸和苯乙酰-L-谷氨酰胺的显著变化。
进一步的代谢组学比较在正离子模式下于BPD和非BPD婴儿之间进行，因为负离子模式未产生显著差异。PCA显示两组之间存在明显的聚类，表明其代谢特征不同。火山图分析鉴定出29种差异代谢物，其中在BPD组中8种上调，21种下调。值得注意的是，5-甲基胞嘧啶水平升高，而苏氨酸-脯氨酸（Thr-Pro）和色霉素A（chrysomycin A）在BPD组中显著下调。这些改变可能反映了疾病相关的代谢紊乱，并为早期诊断或治疗干预提供了潜在靶点。
基于KEGG的功能分析揭示阶段特异性的微生物和代谢通路变化
基于16S rRNA基因预测和非靶向代谢组学的KEGG通路整合分析揭示了微生物群落和宿主代谢在多个层次上存在显著的、阶段特异性的功能改变。在微生物组水平，预测的通路在多个KEGG层级上表现出显著变异。在1级水平，“人类疾病”类别在不同胎龄阶段间差异显著。在2级水平，与“排泄系统”和“信号转导”相关的通路显著富集。在更精细的3级水平，诸如“聚酮化合物糖单元生物合成”、“错配修复”、“链霉素生物合成”和“双组分系统”等功能被显著富集。
与微生物预测一致，代谢组数据的KEGG富集分析进一步支持了胎龄阶段特异性的生物化学转变。在正离子模式下，“牛磺酸和亚牛磺酸代谢”以及“半胱氨酸和蛋氨酸代谢”等关键通路显著富集，表明硫相关代谢功能可能受到发育调控。在负离子模式下，富集的通路主要与碳水化合物和氧化还原代谢相关，包括“抗坏血酸和醛酸代谢”、“果糖和甘露糖代谢”以及更广泛的“代谢通路”。
关键肠道微生物群与粪便代谢物之间的相关性
为了探索早产儿肠道微生物与宿主代谢之间的潜在功能相互作用，研究对前20个细菌属的相对丰度与显著改变的粪便代谢物水平进行了Spearman相关性分析。分析揭示了一个包含正负相关性的网络，强调了属特异性的代谢物关系。值得注意的是，韦荣氏菌属（Veillonella）与D-木糖呈强正相关，提示其在碳水化合物代谢中的潜在作用。相反，链球菌属（Streptococcus）与Lewisγγγ四糖呈显著负相关，暗示其与聚糖代谢改变有关。半胱氨酸的水平与多个菌属显著相关，包括链球菌属、埃希氏菌-志贺氏菌属（Escherichia-Shigella）和分枝杆菌属（Mycobacterium）。尽管未达到统计学显著性，但仍观察到其他趋势。例如，不动杆菌属和假单胞菌属倾向于与D-木糖呈正相关，而狭义梭菌属1（Clostridium_sensu_stricto_1）和链球菌属则与几种代谢物表现出广泛的负相关模式。这些发现突出了不同的微生物-代谢物关联，可能反映了早产儿肠道生态系统内功能性的相互作用，为了解特定细菌类群如何影响或受不断演变的代谢环境的影响提供了见解。
讨论
拟杆菌门演替紊乱作为BPD风险的早期标志
肠道-肺轴是一个通过循环和淋巴途径介导的双向通讯网络，使得肠道微生物能够塑造肺部免疫。在本研究中，健康的早产儿表现出拟杆菌门（Bacteroidota）的规范性演替下降，这与它作为能够代谢人类母乳低聚糖产生有益短链脂肪酸（SCFAs）的早期定植菌的作用相符，从而有助于加强肠道屏障和支持微生物组成熟。相比之下，后续发展为BPD的婴儿则显示出这一轨迹的显著紊乱，在S1阶段出现明显的早期耗竭，且此后恢复甚微。值得注意的是，在三名BPD婴儿中，唯一一例2级BPD患者在两个时间点的拟杆菌门丰度均持续检测不到，而两例1级BPD患者则在后期采样阶段显示出可测量的增加。尽管受限于小样本量，但这种模式提示了一种潜在的严重程度相关趋势：更严重的早期拟杆菌门耗竭可能与更严重的BPD相关。拟杆菌门早期定植失败可能损害新生儿免疫成熟，促进过度的炎症反应。在肺部发育不全的背景下，这种免疫失衡可能使婴儿易患BPD特有的慢性炎症。
早产儿肠道的生态动力学：关键类群的重要性超过整体多样性
新生儿肠道是一个高度动态、非平衡的生态系统，由一小部分先锋物种启动。有趣的是，我们的分析未检测到出生后不同阶段或BPD与非BPD组之间存在显著的α或β多样性差异。这并非反映生物学相似性，而更可能凸显了早期生命微生物组装中“奠基者效应”的主导地位。在这样的系统中，特定关键类群的及时到达可能在决定发育轨迹方面比整体多样性指标更为重要。我们的研究结果例证了这一概念：组间区别的关键特征并非群落范围的多样性，而是拟杆菌门早期定植的失败，这呼应了在坏死性小肠结肠炎（NEC）和败血症中观察到的模式，即疾病风险对应于特定病原菌的存在或缺失，而非整体多样性。
共现网络分析揭示了从早产到晚产阶段微生物相互作用网络的逐步简化。这种转变表明生态成熟趋向于一个更稳定的群落，该群落由宿主免疫发育和上皮分化共同塑造，后者共同充当“生态过滤器”，选择功能相容的类群。
链球菌-韦荣氏菌轴及其与氧化应激的关联
代谢组学分析揭示了早产和中产阶段婴儿的代谢状态受到抑制，包括多种宿主-微生物共代谢物（苯乙酰-L-谷氨酰胺和（3-苯丙酰）甘氨酸）、关键能量底物（D-木糖和β-D-葡萄糖）以及膜相关脂质（1-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱）水平的降低。相反，氧化应激标志物——半胱氨酸（cysteic acid）则显著上调。相关性分析进一步确定韦荣氏菌属（Veillonella）和链球菌属（Streptococcus）形成了一个相互作用的代谢轴。
韦荣氏菌属是一种利用乳酸产生短链脂肪酸的细菌，其与碳水化合物和氨基酸代谢物呈正相关，提示其与代谢成熟相关，并与半胱氨酸呈负相关。相比之下，链球菌属的丰度与半胱氨酸呈正相关，并与所有指示肠道成熟度的代谢物（包括Lewisγγγ四糖）呈负相关。考虑到某些链球菌物种在早产儿中被认为是潜在的病原菌，这些发现表明，以链球菌为主导的环境可能在生命早期促进炎症和代谢失调。
不稳定和应激的早期生命肠道生态系统的功能特征
微生物组-代谢组通路整合分析揭示，早产儿肠道在功能上为竞争和环境感应做好了准备。KEGG“人类疾病”超通路以及具体的“细菌分泌系统”和“双组分系统”通路的富集，表明群落处于高度激活状态。此外，“错配修复”的富集提示存在基因组应激，而“链霉素生物合成”则指向不稳定生态系统中典型的种间拮抗作用。这些微生物组衍生的功能预测与代谢组学在硫氨基酸通路（如牛磺酸和亚牛磺酸代谢以及半胱氨酸和蛋氨酸代谢）中的富集相一致，这些是氧化和炎症应激的标志。总之，这些模式反映了一个缺乏生态稳定性的肠道环境，可能通过微生物活动和代谢输出共同导致宿主易感性增加。
局限性
本研究存在若干局限性。首先，小样本量以及胎龄的变异性限制了统计效力，并增加了临床因素（如抗生素暴露和营养）残留混杂影响的可能性。尽管关键围产期变量已纳入基线表且显示组间无差异，但观察性设计无法进行因果推断。其次，所有分析均基于粪便样本；在新生儿中采集气道样本存在伦理障碍。因此，我们的发现反映了与BPD风险相关的肠道微生物-代谢模式，而非肺部定植的直接证据。先前的研究支持肠道系统性通讯，但需要多部位研究来建立机制联系。第三，缺乏足月儿样本限制了区分BPD特异性特征与早产相关菌群失调的能力。现有文献表明早产儿自然表现出多样性降低和拟杆菌门丰度低，提示本研究观察到的BPD相关失衡可能是早产相关菌群失调的放大。最后，由于只有三名非BPD婴儿在第28天被重新采样，因此观察到的拟杆菌门下降等纵向推论应被视为初步结果。未来需要更大规模的独立队列研究以及肠道、气道和免疫区室的整合分析来验证这些发现并阐明机制通路。
结论
我们的多组学整合分析揭示了早产儿肠道菌群失调与BPD发病机制之间的新颖机制联系。虽然初步分析揭示了组成差异，但基于相关性的深入研究发现了一个关键的功能动态：链球菌属和韦荣氏菌属之间存在显著的负相关关系，这代表了肠道微生物成熟的一个核心轴。链球菌属的富集与指示氧化应激升高的宿主代谢特征密切相关，其特征是半胱氨酸水平升高，并可能促进BPD的后续发展。这项工作为理解肠道-肺轴在BPD病理生理学中的作用提供了新的视角，既为早期风险分层提供了一个多维生物标志物，也为未来的治疗干预提供了一个潜在的微生物-代谢靶点。
