《Microbiology Spectrum》：Genomic and functional dissection of natural transformation-related genes in Piscirickettsia salmonis
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本综述系统解析了鲑鱼立克次体（Piscirickettsia salmonis）中自然转化（NT）相关基因的功能演化。研究发现，尽管编码DNA摄取通道的关键基因comEC被转座元件（TE）普遍中断，但其他NT相关基因（comEA、comFB、comM、comL/bamD、dprA）仍高度保守。通过CRISPRi（CRISPR interference）技术、异源表达等功能基因组学方法，揭示了这些基因在细菌生理和感染过程中的菌群特异性功能，为理解水平基因转移（HGT）相关因子在非转化环境下的生物学意义提供了新视角。
鲑鱼立克次体（Piscirickettsia salmonis）是引起鲑鱼立克次体病（piscirickettsiosis）的病原体，对智利鲑鱼养殖业构成重大健康威胁，并逐渐成为全球鲑鱼生产的潜在风险。尽管其在 aquaculture 中具有重要地位，该菌在功能层面的研究仍相对滞后，部分原因在于其长期存在的遗传操作难题。本研究聚焦于该菌中与自然转化（natural transformation, NT）相关的一组基因，通过整合比较基因组学、转录组分析、异源基因表达以及CRISPR干扰（CRISPRi, CRISPR interference）技术，系统评估了这些基因在鲑鱼立克次体生理及致病过程中的作用。
comEC基因在所有已测序的鲑鱼立克次体基因组中均被截断
对现有全部鲑鱼立克次体基因组的分析揭示了一个关键现象：编码NT过程中DNA摄取通道的关键基因comEC，在所有菌株中均被多种转座元件（transposable elements, TEs）所中断，导致其编码序列（CDS, coding sequence）片段化并失去完整开放阅读框（ORF, open reading frame）。这种中断在不同基因群（genogroup）中呈现出特定的结构模式，共鉴定出14种不同的基因座架构。系统发育分析表明，comEC的中断事件在该菌进化史上发生较早且被固定下来，这可能与基因组内移动遗传元件（MGEs, mobile genetic elements）与NT相关基因座的拮抗协同进化有关。值得注意的是，comEC的普遍失活与鲑鱼立克次体对环境中抗生素抗性基因（ARGs, antibiotic resistance genes）获取的相对“迟钝”现象可能存在关联，暗示其基因组景观可能受到DNA摄取和遗传交换长期限制的塑造。
NT相关基因的一个子集在感染过程中具有转录响应性
尽管comEC失活，鲑鱼立克次体基因组中仍完整保留着多个其他NT相关基因，如comEA、comFB、comM、comL（即bamD）、dprA和recA。这些基因在智利流行的两个主要基因群代表菌株Psal-103（EM基因群）和Psal-104b（LF基因群）之间显示出高度的序列保守性。在鲑鱼头肾来源的SHK-1细胞系感染模型中，qRT-PCR分析显示，comFB、comL、comM和recA在感染48小时后表达显著上调，且上调幅度在Psal-104b中通常高于Psal-103。例如，comFB在Psal-103和Psal-104b中分别上调了72倍和62倍，comM则分别上调了4.6倍和205倍。这表明这些基因在宿主细胞内相互作用过程中保持转录活性，提示它们可能具有独立于NT的生物学功能。
功能验证的comEC同源基因的异源表达损害鲑鱼立克次体生长
为了探究引入功能性comEC的生理后果，研究团队将来自天然感受态细菌（如嗜肺军团菌Legionella pneumophila和霍乱弧菌Vibrio cholerae）的comEC同源基因，以及来自Piscirickettsia litoralis Y2（一株含有完整comEC基因的相近分离株）的comEC基因，通过IPTG诱导的迷你Tn7转座子系统整合到鲑鱼立克次体染色体中。结果表明，诱导表达嗜肺军团菌和霍乱弧菌来源的comEC同源基因，对Psal-103和Psal-104b均造成了严重的生长抑制，而在固体培养基上的连续稀释点种实验也证实了其生存力下降。相反，表达P. litoralis Y2的comEC同源基因则未观察到明显的生长缺陷。RT-qPCR证实了所有构建体在IPTG诱导下均能有效转录。值得注意的是，在作为基因传递供体的大肠杆菌S17-λ pir中，即使质粒携带多拷贝的上述comEC基因，也未出现类似的生长抑制，表明这种毒性效应是鲑鱼立克次体特异性的。这一发现为理解comEC在所有鲑鱼立克次体菌株中被持续选择性中断提供了可能的解释：引入某些功能性comEC同源基因会带来显著的适应性代价。
通过CRISPRi抑制对鲑鱼立克次体中NT相关基因的功能分析揭示了Psal-103和Psal-104b之间的菌株特异性表型
研究利用CRISPRi技术，在Psal-103和Psal-104b中分别条件性敲低了comFB、comL/bamD、comEA、comM、dprA和recA这六个NT相关基因，以评估它们在对数期无细胞培养基生长和SHK-1细胞感染模型中的重要性。
在无细胞培养基中，CRISPRi介导的comL/bamD抑制对Psal-104b的生存力造成了严重损害，表明该基因对于LF基因群代表菌株在无细胞条件下的生长是必需的。然而，在Psal-103中抑制comL/bamD或其他任何目标基因，均未检测到对生长的显著影响，提示comL/bamD表现出基因群特异性的必需性。comL最初在淋病奈瑟菌中被鉴定为NT所必需的脂蛋白，后续研究发现其编码高度保守的周质脂蛋白BamD，是大多数革兰氏阴性菌中β-桶状组装机器（BAM, β-barrel assembly machinery）的一个组成部分。BAM复合物负责外膜蛋白的正确插入和折叠，其中BamD在许多物种中与核心组分BamA一样是维持生命所必需的。
在SHK-1细胞感染实验中，诱导CRISPRi抑制目标基因表达。结果发现，抑制comL/bamD不仅导致Psal-104b（如前所述，其在无细胞条件下即致死）几乎完全丧失细胞病变效应，也在Psal-103中显著降低了细胞病变活性（约为野生型的85%），表明该基因在感染过程中具有重要作用，尽管其在Psal-103的无细胞培养基中非必需。
抑制comM在Psal-103和Psal-104b中均显著降低了细胞病变效应，提示其在感染相关过程中具有保守功能。抑制comFB在Psal-104b中引起感染进程的轻微延迟，但在Psal-103中无此现象。recA的抑制仅在Psal-103中导致细胞病变效应显著降低，而在Psal-104b中无影响，反映了基因群间在DNA修复和应激反应动态方面的潜在差异。对于comEA和dprA，在Psal-104b中未检测到表型效应；在Psal-103中，抑制comEA与细胞病变效应的适度但显著的减少相关，而抑制dprA则未产生统计学上显著的效应。
这些功能分析结果表明，尽管鲑鱼立克次体失去了进行自然转化的核心能力（由于comEC的失活），但其基因组中保留的多个NT相关基因仍然以基因特异性及基因群特异性的方式，贡献于细菌的适应性，特别是在宿主细胞内生存和致病的环境中。例如，comL/bamD在Psal-104b中的必需性及其在Psal-103感染中的重要性，凸显了BAM复合物在细菌包膜稳态和致病性中的关键作用。comM在感染中的保守角色则暗示其可能参与如应激耐受或毒力相关通路等过程。
本研究不仅揭示了鲑鱼立克次体中NT相关基因在NT功能丧失背景下的演化命运和当代功能，更重要的是，建立了一个结合CRISPRi、位点特异性染色体整合和异源基因表达的多功能遗传学平台，为未来深入探索该病原体的生物学特性、开发新的生物技术控制策略奠定了基础。研究中观察到的Psal-103和Psal-104b之间的表型差异，也强调了在针对该病原体的研究和管理策略中，需要考虑其基因群多样性。
