《mSystems》：Ecological dynamics of three persistent opportunistic pathogens in hospital sinks and their potential antagonistic bacteria
编辑推荐：
本综述系统性揭示了新生儿重症监护室（NICU）水槽排水管作为机会致病菌（OPs）持续定植库的生态学机制。研究发现，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、粘质沙雷菌（Serratia marcescens）和嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）的定植模式受微生物群落组成、余氯浓度及水龙头设计等生物/非生物因素共同调控。尤为重要的是，分离出的代尔夫特菌（Delftia tsuruhatensis）Dt1S33株在体外实验中显示出抑制病原菌生物膜形成的能力，为利用微生物拮抗作用控制医院环境病原菌提供了新思路。
ABSTRACT
新生儿重症监护室（NICU）中受机会致病菌（OPs）污染的水槽是医疗保健相关感染（HAIs）的重要来源，导致显著的发病率和死亡率。理解病原菌在水槽环境中的行为对于预防其传播至关重要。本研究采用综合方法研究了三种主要细菌病原体：铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）和粘质沙雷菌（Serratia marcescens）。研究对两个NICU的水槽排水管进行了为期2个月和5个月的采样，并在基因型水平上确定了机会致病菌的多样性和丰度。研究分析了其出现与微生物群落、水质参数、水龙头设计和水槽使用情况的关系。结果显示，铜绿假单胞菌、粘质沙雷菌和嗜麦芽窄食单胞菌的检出率分别为47%、39%和67%。每个水槽内的基因型多样性较低，每个物种/样本通常有1-3个基因型。优势基因型在整个采样期间持续存在，表明机会致病菌菌株在排水管中具有持久性。所研究细菌序列类型的定量范围在103到107DNA拷贝/毫升之间。三种物种在不同水槽排水管之间的异质性空间分布主要归因于群落组成的变化、氯浓度和水龙头设计。研究分离出一株代尔夫特菌（Delftia tsuruhatensis）Dt1S33，其在水槽环境中的存在与三种机会致病菌呈负相关。在实验室共培养中，Dt1S33降低了病原菌形成生物膜的能力。这些发现强调了生物和非生物因素在病原菌定植水槽排水管中的关键作用。
INTRODUCTION
医疗保健相关感染（HAIs）是一个重要的公共卫生问题，给医疗系统带来了巨大的负担和高昂的成本。高达30%的HAIs发生在重症监护室，导致感染患者的死亡率增加52%。在加拿大，2010年至2016年间，约有12%的HAIs发生在新生儿重症监护室（NICUs）。水槽环境为革兰氏阴性机会致病菌（OPs）的增殖提供了理想的生态位。其中，铜绿假单胞菌、粘质沙雷菌和嗜麦芽窄食单胞菌因其固有的抗生素耐药性和与HAIs的频繁关联而备受关注。这些细菌物种在受人类活动影响的环境中或自然环境和各种宿主中无处不在。它们在潮湿条件下茁壮成长，并表现出代谢多样性，使其能够适应各种生态位，包括医疗设施和患者相关设备。它们形成生物膜的能力，通常受群体感应信号调控，使其能够粘附并在不同表面生长，这是重要的毒力因子并增强了其抵抗力。这些细菌以其对抗菌剂的耐受性和作为机会致病菌的作用而闻名，可引起广泛的人类器官感染。由多重耐药菌株引起的HAIs暴发，特别是铜绿假单胞菌和粘质沙雷菌，在NICUs中屡有报道，导致极早产儿显著的发病率和死亡率。尽管先前的研究表明医院水槽可以携带持续的OP种群，但大多数工作集中在物种水平检测或基于培养的方法。然而，环境条件和常驻微生物群对NICU排水管中OP基因型分布的影响仍然知之甚少。本研究通过检查三种临床相关OPs（铜绿假单胞菌、粘质沙雷菌和嗜麦芽窄食单胞菌）在NICU水槽排水管中的存在是否与环境条件和共存的微生物群落相关，来弥补这些空白。据我们所知，这是首个在基因型水平上表征它们在NICU排水管中分布的研究。我们还评估了常驻类群在调节OP出现中的潜在作用，包括代尔夫特菌Dt1S33与减少OP定植的关联。
MATERIALS AND METHODS
本研究在两个NICU中进行：NICU#1建于2015年，拥有80张床位，主要是单人间和五个双胞胎双人间；NICU#2建于2000年之前，布局不同，所有患者在一个拥有16张床位的大房间内。NICU#1和NICU#2的水槽分别以前缀“1”和“2”标识。由于水龙头样本（自来水和起泡器生物膜）的污染似乎是随机事件而非系统性因素，因此被排除在分析之外。
水槽排水管采样和处理
在NICU#1，于2020年1月至2月期间，每两周采样一次，持续6周（每个水槽采样三次）。在NICU#2，于2020年8月至12月的5个月期间进行了五次采样活动。所有水槽在每个采样日期按随机顺序采样。样品在6小时内处理。在NICU#2，排水管生物膜拭子和排水管水一起处理，并视为单一的“生物膜悬浮液”。该决定基于NICU#1初步采样活动的观察结果，其中生物膜和水样显示出高度相似的病原体检测谱。此外，拭子操作本身会使拭子浸入排水管水中，导致两种基质之间的交叉交换。因此，合并两部分可以提供更综合的排水管环境表征，同时简化样品处理而不损害微生物检测的完整性。样品检测三种OPs的存在：铜绿假单胞菌、粘质沙雷菌和嗜麦芽窄食单胞菌。对排水管水（WD）和排水管生物膜（BD）样品进行了环境基因组DNA（eDNA）的直接分析。每次采样时监测自来水理化参数，包括流速、温度、pH、电导率、溶解氧以及总氯和余氯。还测量了排水管水的浊度。
水槽使用频率估计
通过使用连接数据记录器的温度表面传感器，每30秒测量一次冷热水进口处的温度波动，来估计水槽使用频率。
三种OPs的检测和基因分型
通过靶向相应的高通量短序列分型（HiSST）方案的三个或四个位点的PCR分析分离株，该方法等同于脉冲场凝胶电泳（PFGE）的区分能力。主要通过PCR筛选eDNA样品中每种OP的出现，仅靶向相应HiSST方案的一个区分位点以减少操作量，使用bssA检测粘质沙雷菌，pheT检测铜绿假单胞菌，glnG检测嗜麦芽窄食单胞菌。文库池在Génome Québec测序中心进行测序，使用Illumina MiSeq PE-250平台。使用针对HiSST方案调整的DADA2流程处理原始测序读数，使用GitHub存储库上提供的R脚本“Script_RUN_FunHiSSTDada2.R”和“FunHiSSTDada2.R”功能。
多样性分析
通过分析eDNA提取物监测水槽微生物群的分类组成。通过PCR扩增16S核糖体RNA基因的高变区V3–V4（465 bp）。将等摩尔的PCR扩增子混合物送去进行Illumina MiSeq PE-250测序。每个样品的目标读数为30,000–40,000。在RStudio环境中使用DADA2流程进行质量控制、读长配对组装和嵌合体去除。将显示100%同一性的过滤序列汇集为扩增子序列变体（ASV）。然后将每个ASV的代表性序列与SILVA rRNA数据库项目中的参考序列进行比较。最终产品是检测到的ASV列表、它们的分类学及其在每个样品中的分布（相对丰度）。在进行多样性分析之前，过滤ASV表以去除计数为零的水槽位点和对应于三个目标OPs的ASVs。然后使用vegan包的decostand函数进行Hellinger转换对群落数据进行标准化，以校正测序深度差异并减少双零值的影响。在约束排序之前对环境变量进行标准化（z-score），并根据成对相关性和方差膨胀因子（VIF）得分>5去除高度共线性参数。随后将标准化的群落矩阵用于基于Bray-Curtis距离的冗余分析。
三种OPs的定量
使用微滴数字PCR（ddPCR）评估采样期间水槽排水管中OPs的平均丰度。在两个NICU内筛选了三个不同的采样日期。这包括NICU#1活动的所有采样日期，以及NICU#2五次采样日期中的三次子集。使用针对pheT位点设计的引物进行铜绿假单胞菌定量的单重PCR，每个引物终浓度为100 nM。优化了双重PCR以实现粘质沙雷菌和嗜麦芽窄食单胞菌的同时定量，分别靶向bssA位点（引物各100 nM）和glnG位点（引物各250 nM）。详细的ddPCR制备程序和PCR条件在补充方法中提供。
统计分析
在R环境中进行统计分析，以探索解释OPs存在和水槽排水管微生物群组成的变量。首先，通过计算各种多样性估计值和指数来估计物种数量及其相对丰度，包括物种丰富度和香农指数、辛普森指数。通过一系列涉及ASV矩阵和理化参数的多元分析，对变量如何影响OPs的存在和浓度进行了全面评估。这些分析包括方差置换分析、广义混合模型、典型冗余分析和变异划分。出于多元分析的目的，在NICU#1和NICU#2的三次或五次采样日期中，仅一次呈阳性的水槽被归类为总体OPs阴性。这种分类是为了避免假阳性偏差，并基于这样的假设：此类出现代表零星污染而非真正的OP定植。
潜在细菌拮抗剂的分离和体外测试
为了实验验证对OPs的拮抗活性，我们检索了对应于水槽排水管1-S33的ASV-1的细菌菌株。用排水管样品1-S33接种麦康凯琼脂平板，并在室温（22°C）下培养72小时。一种单一的菌落形态占主导地位。在22°C的胰蛋白酶大豆琼脂上纯化菌落72小时。将纯培养物的单个菌落接种到3 mL胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）中，在22°C下振荡培养72小时。使用先前描述的程序提取DNA。相应的菌株被命名为Dt1S33。为了评估拮抗试验中OPs的流行情况，使用Tn7-lux或Tn7-gfp元件对细菌菌株进行染色体标记。铜绿假单胞菌PA14和嗜麦芽窄食单胞菌810-2的标记菌株分别称为PA14-lux或SM810-GFP。由于粘质沙雷菌的染色体标记未成功，因此将该物种排除在实验之外。在生物膜形成的背景下研究了Dt1S33对菌株PA14-lux和SM810-GFP的拮抗潜力。对于铜绿假单胞菌，制备了Dt1S33与PA14-lux比例为1:1、2:1和4:1的细菌悬浮液。对嗜麦芽窄食单胞菌应用了相同的方法，但略有修改。病原菌在所有条件下以相同浓度接种在96孔板中，而Dt1S33接种量根据比例进行调整。在22°C孵育24小时后，用培养基洗涤96孔板以去除浮游细菌，并向每个孔中加入新鲜培养基。使用Cytation3多功能微孔板读数仪量化生物膜中PA14-lux或SM810-GFP的总体存在。为了验证对OP菌株的特异性，通过用阴性对照菌株洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cenocepacia）K56-2替代代尔夫特菌Dt1S33来重复该程序。该菌株与代尔夫特菌属于同一目（Burkholderiales）。
RESULTS
OPs随时间推移定植大多数水槽排水管
由于理解OPs的动态可能揭示影响其在NICU水槽环境中存在的因素，我们调查了三种OP物种在水槽排水管中的时间和空间基因型分布。除NICU#2中很少使用的水槽2-S23和NICU#1中无明显解释的水槽1-S33外，两个NICU中的所有水槽至少对一种受监测的OPs检测呈阳性。平均而言，在任何给定时间，超过一半（51%）的水槽排水管被至少一种OP物种定植。阳性排水管样本的发生率在两个NICU中随时间保持相对一致，无论涉及何种特定病原体。在连续几周内，同一排水管中鉴定出接近甚至相同的HiSST基因型谱。两个NICU中每个水槽排水管的OPs多样性均较低，每个样本平均有两种不同的基因型。其中，粘质沙雷菌在水槽内的基因型多样性最低，通常显示单一优势基因型，最多有四个不同的短序列类型（SSTs），具体取决于样本和靶向位点。相比之下，嗜麦芽窄食单胞菌在水槽中显示出最高的基因型多样性，根据NICU和靶向位点的不同，有4-10个独特的SSTs。值得注意的是，除OPs阴性的水槽2-S23外，NICU#2中的所有水槽排水管都被相同的粘质沙雷菌基因型定植。其他基因型（显示gabR位点的三个不同SSTs）仅在一次采样活动中检测到，与一个排水管样本（2-S28）中的优势基因型同时存在。这些零星的基因型随后不再被发现，而优势基因型在后续采样中仍然可检测到。从排水管2-S29中分离出优势粘质沙雷菌基因型（菌株BWD29-0280-Sm1），使用HiSST分析进行基因分型，并通过全基因组测序（WGS）确认。
NICU水槽排水管被三种OPs的广泛基因型多样性定植
在确定不同排水管内的多样性非常低之后，我们随后调查了铜绿假单胞菌、粘质沙雷菌和嗜麦芽窄食单胞菌在两个NICU环境中的排水管样本的水槽间基因型分布。总体而言，OPs的空间分布模式在水槽间表现出异质性，反映了同一NICU内不同水槽之间存在不同菌株。值得注意的是，在NICU#1中，有两个实例，位于不同房间但共享一个共同排水收集器的水槽对显示出密切相关的基因型。具体来说，水槽1-S26和1-S27被密切相关的粘质沙雷菌基因型定植，而水槽1-S17和1-S18显示出密切相关的粘质沙雷菌和嗜麦芽窄食单胞菌基因型。偶尔，两个水槽被同一基因型定植更可能是由于它们位置接近（例如，1-S8和1-S10），而不是共享排水系统（例如，1-S7和1-S8）。而在另一种情况下，从水槽1-FK和1-BR检索到的铜绿假单胞菌eDNA之间的遗传接近性可能主要与外部使用者（例如，访客）而非NICU医护人员相关。在NICU#2中，OPs阳性的水槽集中在一个有限区域内，大部分在同一房间内，这可以解释与NICU#1相比，水槽间HiSST谱更接近的原因。重要的是，两个NICU中的洗手站对所有三种OPs都表现出最高的定植率，从水槽1-HWSs和2-S29取样的生物膜悬浮液中每种OP的基因拷贝数超过105每毫升。水槽通常被OPs以每毫升103到105基因拷贝的水平定植，峰值达到每毫升107基因拷贝。值得注意的是，在NICU入口处水槽中鉴定出的SSTs通常存在于NICU的其余水槽中。
所有三种OPs的流行由少数细菌类群驱动
OPs的出现与水槽细菌群落之间存在强烈关联。由于与其他参数显著共线性，一些非生物变量被从冗余分析中排除（例如，pH和余氯浓度）。在NICU#2的情况下，考虑了水温，但由于其与其他参数（冷热水进口分离、pH、电导率、溶解氧）强烈共变，因此从冗余分析中省略。两个NICU内水槽的相对空间位置由沿经验轴定义的X和Y坐标确定，这些轴横跨水槽的分布。水槽排水管内微生物群落的结构组成突出了患者房间内的水槽与公共区域洗手槽之间的区别。值得注意的是，NICU#1患者水槽排水管中的主要ASV被鉴定为代尔夫特菌（Delftia sp.），而该属在公共区域的四个水槽排水管（水槽1-FK、1-ML、1-HWSs和1-BR）中丰度较低。在NICU#2中，观察到两个专门由医护人员使用的位于中心位置的水槽（水槽2-S22和2-S28）的微生物群组成显著相似，以伊丽莎白菌属（Elizabethkingia）为主。影响细菌群落组成的因素在所研究的两个NICU之间有所不同。在NICU#1中，两个关键因素显著解释了水槽排水管内细菌群落组成的变化：余氯浓度和
