《Stem Cell Reports》：Systematic transcriptome analysis reveals the function of alternative promoters in hematopoietic lineages
编辑推荐：
本研究通过构建造血过程高分辨率启动子活性图谱，发现1,074个动态启动子，首次揭示Pou2f1和Ikzf1的细胞类型特异性启动子使用模式，并鉴定出Spi1、Foxo1、Yy1和Pax5等关键转录因子驱动启动子选择，为靶向疾病中启动子特异性机制奠定基础。
在生命科学的精密调控网络中，基因表达调控始终是核心议题。作为转录起始的关键控制点，启动子通过整合转录因子结合、表观遗传修饰等信号，决定基因的转录输出。特别有趣的是，许多蛋白编码基因采用多个启动子（即替代启动子），这些启动子能够产生不同的转录本亚型，从而显著增强转录组的复杂性，实现组织特异性表达和对生理刺激的动态响应。
在造血系统中，这种调控机制显得尤为重要。造血过程需要精确的转录调控来支持多样化免疫细胞群体的发育和进一步亚群分化。例如，RUNX1基因通过远端P1和近端P2启动子分别产生Runx1c和Runx1b亚型，在巨核细胞特化、成熟和血小板生成中发挥关键作用。类似地，SATB1基因在胸腺细胞中利用四个替代启动子，其使用模式随着发育过程动态变化，且依赖于TCR信号。这些研究都表明替代启动子在造血和免疫细胞发育中具有重要功能。
然而，尽管个别基因的启动子功能已有研究，但由于技术限制（如批次效应和阶段覆盖不足），对造血过程中启动子活性动态的系统性分析仍然缺乏。传统方法如CAGE（基因表达帽分析）在全面揭示替代启动子使用方面存在局限。随着高通量RNA测序技术的发展，现在可以通过深度批量RNA-seq数据同时量化启动子活性和揭示替代使用情况，为系统性研究提供了新的机遇。
在这项发表于《Stem Cell Reports》的研究中，张宝军团队通过分析532个RNA测序数据集，构建了造血过程中高分辨率的启动子活性图谱，揭示了替代启动子在造血谱系中的关键作用。
研究人员主要运用了几项关键技术：首先，利用proActiv工具对532个造血干细胞、前体细胞和终末分化谱系的RNA-seq数据集进行启动子活性定量分析；其次，通过CRISPRi（dCas9-KRAB）系统进行启动子特异性转录抑制实验；第三，采用ATAC-seq、ChIP-seq和Hi-C技术分析染色质可及性、转录因子结合和三维基因组构象；此外，还通过双荧光素酶报告基因实验和流式细胞术验证了启动子功能及其对翻译效率的影响。值得注意的是，所有实验使用的样本均来自公共数据库和实验室构建的小鼠模型，包括NSG（NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ）小鼠。
研究结果
造血谱系的启动子活性全景图谱
通过分析532个RNA-seq数据集，研究人员构建了涵盖57种细胞类型的启动子活性图谱。他们发现约10%的蛋白编码基因启动子在所有样本中被分类为主要启动子，20%为次要启动子，其余在造血发育过程中未检测到激活。主要启动子主要位于最5'端位置，而次要启动子在下游位置比例逐渐增加，表明基因亚集存在活跃的下游启动子。聚类分析显示，启动子活性谱能够将相关细胞类型聚集在一起，反映了细胞类型特异性调控。
替代启动子的序列特征鉴定
研究人员重点关注了动态启动子行为，发现11,907个启动子在造血分化过程中经历了从次要/非活跃状态到主要状态的转变。序列分析显示，主要启动子中的TATA框和YY1基序具有明确的空间模式，与转录方向一致，而次要启动子中这些基序的方向一致性仅为约50%，表明主要启动子主要依赖经典转录机制，而次要启动子可能通过替代转录机制运作。
谱系特异性替代启动子的识别
通过主成分分析，研究人员鉴定了1,074个高影响力启动子，这些启动子对应的基因包括转录因子、支架蛋白、转运蛋白等。其中68%的启动子调控参与造血/免疫调节的基因。他们特别关注了Ikzf1和Pou2f1基因，发现Ikzf1的P1启动子在B细胞和单核细胞中活跃，而P2启动子主要在T细胞中活跃；Pou2f1的P1启动子在T/NK细胞/单核细胞中活跃，而P2启动子具有B细胞/祖细胞特异性。
调控替代启动子的上游转录因子
通过ATAC-seq分析和motif富集分析，研究人员发现Pou2f1和Ikzf1启动子使用受到特定转录因子调控。相关性分析和实验验证表明，Spi1调控Ikzf1 P1，Foxo1调控Ikzf1 P2，Yy1调控Pou2f1 P1，Pax5调控Pou2f1 P2。染色质免疫沉淀测序证实了这些因子在相应启动子区域的结合。
替代启动子通过5'UTR多样性介导翻译效率
研究人员发现Pou2f1和Ikzf1启动子使用影响5'非翻译区（5'UTR）特征，进而调控翻译效率。特别是Pou2f1的P2来源的5'UTR比P1来源的5'UTR具有显著更高的翻译效率，这解释了为什么Pou2f1在B细胞中的蛋白水平远高于T细胞。
Pou2f1替代启动子对造血谱系分化的功能影响
通过CRISPRi实验，研究人员发现抑制Pou2f1 P1启动子显著降低了T细胞、髓系细胞和NK细胞的重建，而抑制P2启动子选择性损害了B细胞发育，表明P1启动子在多种造血谱系中具有广泛功能，而P2启动子具有B细胞特异性作用。
B细胞中Pou2f1 P1与P2启动子间的相互作用
Hi-C分析揭示了B细胞特异的染色质环连接Pou2f1的P1和P2启动子，而在T细胞中，P1与Cd247基因的启动子和转录起始位点相互作用。这种细胞类型依赖的染色质构象差异表明P1在T细胞中作为典型启动子，而在B细胞中获得增强子样特性。
研究结论与意义
本研究通过系统性转录组分析，构建了小鼠造血过程中启动子活性的动态图谱，为理解基因表达调控提供了宝贵资源。研究发现不仅证实了替代启动子在造血谱系分化中的关键作用，还揭示了其通过5'UTR多样性影响翻译效率的新机制。
特别值得注意的是，研究发现了启动子-启动子相互作用的现象，即同一基因的主要和次要启动子之间可以形成染色质环，这种相互作用具有细胞类型特异性。在Pou2f1基因座中，P1启动子在B细胞中表现出增强子样功能，调控P2启动子的活性，这扩展了我们对启动子功能多样性的认识。
从机制层面，研究明确了Spi1、Foxo1、Yy1和Pax5等转录因子作为上游调控因子，直接决定了Ikzf1和Pou2f1替代启动子的细胞类型特异性使用。这些发现为理解造血和免疫细胞发育中的转录调控网络提供了重要见解。
这项研究的临床意义在于，由于异常启动子使用与多种疾病特别是癌症相关，该研究建立的平台和方法为靶向疾病中启动子特异性机制奠定了基础。未来可能通过调控特定启动子的使用，实现对基因表达的精确干预，为疾病治疗提供新策略。
总之，该研究将替代启动子定位为造血和免疫细胞分化中的动态调控枢纽，深化了对基因表达控制的理解，并为发育和疾病中的未来研究建立了概念基础。
