《Food Chemistry》：Determination of vitamin K1 (phylloquinone) and K2 (menaquinones 4–10) in a broad range of matrices by HPLC with electrochemical reduction and fluorescence detection
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维生素K1、2H-κ1及甲萘醌MK4-MK10的同步分析方法开发与验证，优化液液萃取溶剂和C30色谱柱梯度条件，实现cis/trans异构体分离及0.1-0.2μg/kg低限定量，适用于食品、补充剂及生物样本。
Kari Elin R?d karielin | Annbj?rg B?kevoll | Amalie Moxness Reksten | Lisbeth Dahl | Eystein Oveland
挪威卑尔根市Nordnes，邮政信箱1870，海洋研究所
摘要
本文开发了一种分析方法，能够同时测定维生素K1（叶绿醌）、β, γ-二氢K1和K2（甲萘醌4–10）的顺式-反式异构体，并对其在多种食品基质、组织液和补充剂中的适用性进行了全面验证。提取程序和液-液萃取后的溶剂经过优化，使得回收率达到了80%至118%。通过使用更长的HPLC柱和梯度洗脱，提高了维生素及其异构体的分离效果。维生素K的形式通过自动进样器高效注入外部标准曲线（R2 ≥ 0.999）。在荧光检测之前，维生素K通过在线柱后电化学还原单元被有效还原为氢醌。通过分析参考物质和添加了维生素K的样品，所有维生素形式的定量限（LOQ）约为0.1 μg/kg，除了MK-6和MK-10为0.2 μg/kg。K1和K2形式的日内和日间精密度（以2RSD表示）通常在8%左右。
引言
维生素K是一种脂溶性维生素，天然存在于食物中，分为维生素K1（C31H46O2，叶绿醌）和维生素K2（甲萘醌，MKs），它们具有共同的化学结构单元——2-甲基-1,4-萘醌（C11H8O2），通常称为甲萘醌（Halder等人，2019；Schurgers & Vermeer，2000）。维生素K1主要由光合植物和藻类合成，存在于叶绿体的类囊体膜中（Gross，2006），而MKs则主要由细菌合成（Beulens等人，2013）。在人体中，维生素K1和MKs在血液凝固过程中起着关键作用，并对心血管和骨骼健康有益（Akbulut等人，2020；Beulens等人，2013；Dam & Schonheyder，1936；Halder等人，2019；Schurgers & Vermeer，2000）。（见图1、图2、图3。）（见表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8。）
维生素K1是主要的膳食来源，富含维生素K1的食物包括深绿色叶类蔬菜（如羽衣甘蓝、菠菜、芥蓝和芜菁叶），以及十字花科蔬菜（如西兰花和布鲁塞尔芽菜）（Gross，2006）。维生素K的氢化形式β, γ-二氢K1（2H-K1）可以在富含维生素K1的植物油进行合成氢化过程中产生（Davidson等人，1996）。含有氢化脂肪的植物油和食品在西方饮食中是维生素K每日摄入量的重要来源（Booth等人，1996；Booth等人，1999），因此测定2H-K1也非常重要。MKs的3-取代脂质侧链长度各不相同，取决于异戊二烯单元的数量（MK-n，4 ≥ n ≤ 13），在发酵食品（如乳制品）中含量较高，但MK-4也存在于鱼类和肉类产品中（Kamao等人，2007；Schurgers & Vermeer，2000）。欧洲食品安全局（EFSA）建议维生素K1的适宜摄入量为每天每公斤体重1 μg，但由于数据不足，尚未为MKs设定膳食参考值（Efsa膳食产品小组，2017）。需要更准确地确定不同MKs的膳食含量，因为某些MKs的吸收率和生物利用度高于维生素K1，并且会随MK链长度的不同而变化（Fu等人，2017；Shearer等人，2012）。因此，建议为维生素K2设定单独的膳食参考值（Akbulut等人，2020）。
目前，仅有一种公认的用于测定食品中维生素K的标准方法，该方法仅专注于测量维生素K1：“CEN EN 14148: 2003 食品——通过HPLC测定维生素K1”。缺乏测定MKs的官方标准方法可能是由于缺乏明确的膳食指南以及存在需要克服的若干分析挑战。
已经开发了几种利用HPLC结合荧光或质谱检测的方法来测定维生素K1和MKs（Zhang等人，2019）。然而，这些方法的整体分析性能并不总是最佳，例如，并非所有MK形式和2H-K1都被包括在内，或者灵敏度较低，且有些方法尚未在广泛的基质范围内得到充分验证。常用的方法是HPLC结合荧光检测，在柱后使用锌柱将维生素K还原为氢醌以进行荧光检测（Koivu-Tikkanen等人，2000；Manoury等人，2013）。为了提高复杂基质中的选择性，还引入了多种策略，如HPLC柱切换（Tanaka & Tanaka，2024）。此外，还开发了利用LC-MS/MS结合ESI或APCI离子化源来测定食品（Jensen等人，2021；Jensen等人，2022；Karl等人，2014；Palmer等人，2021；Tarvainen等人，2019）和血清（Karl等人，2014；Meinitzer等人，2022；Wang等人，2025）中的维生素K1和K2的分析方法。
本研究的目的是开发一种高效准确的维生素K分析方法，该方法不仅能测定维生素K1，还能测定2H-K1、MK-4至MK-10，能够区分顺式-反式异构体，并适用于多种食品、维生素补充剂和组织液。我们研究了是否可以进一步改进CEN EN 14147方法以解决这些分析挑战，因为LC-FLD方法具有高灵敏度、高稳健性、维护要求低且成本效益高的优点。我们的目标是在同一LC-FLD分析过程中同时定量维生素K1、2H-K1和MKs，并引入了一种高效、稳健且几乎无需维护的在线柱后电化学还原单元，以替代CEN EN 14147中使用的锌还原法。
在同一分析过程中测定所有维生素K形式通常较为复杂，因为它们在食品中的浓度范围广泛，且长链MKs的非极性特性可能导致定量和选择性受到内源性脂质的干扰（Zhang等人，2019）。我们通过改变自动进样器的样品体积、使用更长的分析柱（C30柱）以及优化HPLC梯度来解决这一问题，从而改善分离效果（Cook等人，2002）。这对于考虑维生素K的生物非活性顺式形式以及在分析标准品中存在的可检测量的顺式形式非常重要。例如，在强化食品和饲料中可能存在人工合成的生物非活性顺式维生素K形式（Lal & Berenjian，2020），这些形式需要与生物活性反式形式区分开来。在之前开发的分析方法中，这一分析挑战尚未得到妥善解决。
一些长链MKs存在于高脂肪食品中，已经采用了多种策略来提高不同基质的提取效率：液-液萃取、蛋白质沉淀、固相萃取、脂肪酶预处理和酸性水解（Koivu-Tikkanen等人，2000；Woollard等人，2002；Zhang等人，2019）。本研究探讨了不同的提取程序和液-液萃取后的溶剂，以改善MK形式的提取和溶解度。所提出的方法是一种通用的LC-FLD分析方法，适用于多种基质：不含叶绿素的样品、含叶绿素的样品、维生素片剂和血清样品。根据NMKL程序4进行了完整的单次实验室验证，为未来的标准化工作提供了支持。
试剂和材料
用于维生素K1测定的标准参考物质（SRM）包括：美国国家标准与技术研究院（NIST，马里兰州盖瑟斯堡）提供的SRM 1846（婴儿配方奶粉）、SRM 1849a（婴儿/成人营养配方奶粉）和SRM 3280（多种维生素/多种矿物质片剂）。英国伦敦Synnovis公司的KEQAS（维生素K外部质量保证计划）SRM-002血清用于血清样品的检测（Card等人，2022）。目前暂无其他可用SRM。
方法优化
对CEN EN 14148:2003方法进行了修改和优化，以包括顺式-反式异构体、MK-4至MK-10以及2H-K1的测定。具体修改包括：改进的提取程序（2.3.1、2.3.2、2.3.3）、优化液-液萃取后的溶剂以提高MK的溶解度、使用自动进样器进行不同体积的注射、优化HPLC梯度以及更换为更长的色谱柱。
结论
所开发的分析方法能够有效测定维生素K1、β, γ-二氢K1和MK-4至MK-10，具有选择性（能够区分顺式和反式异构体）、高灵敏度（LOQ范围为0.1–0.2 μg/kg）、良好的线性（标准曲线的R2 ≥ 0.999）、高精度（K1的2RSD < 8%，K2形式的2RSD < 10%）和高准确度（80–118%）。该方法具有足够的定量范围，通过调整注射体积可以扩展该范围。
作者贡献声明
Kari Elin R?d karielin：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法验证、实验设计、资金筹集、数据分析、概念构思。Annbj?rg B?kevoll：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、方法验证、监督、资源协调、实验设计、数据管理、概念构思。Amalie Moxness Reksten：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法验证。
资金来源
本研究在挪威卑尔根的海洋研究所进行。挪威食品安全局在购买某些维生素K标准品方面提供了财政支持，但我们未从公共、商业或非营利部门获得任何特定资助。
未引用的参考文献
CEN EN 14148, 2003
Sele等人，2023
Turck等人，2017
植物基食品和饮料中的有害物质，2025
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
